この資料では、単細胞の海藻の遺伝的形質転換を説明<em> Ostreococcusタウリ</emエレクトロポレーションによる>。この真核生物では、大幅に減少し、ゲノムと細胞の複雑さを憑依し、細胞培養と化学生物学の両方に容易に従順され、高等植物のための有効なモデルのプラットフォームです。
植物科学の急速な進歩を妨げる一般的な問題は、細胞、組織および生物全体の複雑さ、および高等植物の簡単な遺伝学に影響を与えるゲノムの冗長性の特に高いレベルが含まれています。小説のモデル生物Ostreococcusタウリ型は、日付に知られている最小の自由生活真核生物であり、大幅に減少ゲノムサイズと細胞の複雑さの1,2を有しており 、あたりほとんどの細胞小器官の一つの存在(ミトコンドリア、葉緑体、ゴルジスタック)によって明らかにセル、唯一の〜8000の遺伝子を含むゲノム。さらに、unicellularityと容易に文化の組み合わせは、ケミカルバイオロジー的アプローチの影響を受けやすいプラットフォームを提供します。最近、Ostreococcusが正常に概計時3-6基礎となる基本的なメカニズムを研究するために採用されている。このモデル生物からの結果は、植物科学だけでなく、哺乳類の生物学7だけでなく、影響を与えています。この例は、どのように迅速な実験に焦点を当て緑系統からの単純な真核生物は、複雑さの低減のこの背景には技術的に可能な方法を使用して検証可能な仮説を生成することによって、より複雑な生物の研究を加速することができます。ゲノムや遺伝子を変更する可能性の知識はすべてのモデル種で欠かせないツールです。遺伝的Ostreococcusを変換する以前に報告された方法6,10は世界でも数少ない研究室によく知られているのに対し、ゲノムの1、トランスクリプトーム8、この種のプロテオミクス9については、自由に利用可能です。
この記事では、遺伝的に過剰発現してこの小説のモデル生物を変換するための実験方法はから発信された変換線の選択を可能にするためにエレクトロポレーションを用いて詳細に説明されて、同様に低い割合アガロースで形質転換細胞の封入の方法で構築する単一の形質転換細胞。 Ostreocoの成功したアプリケーションは、次概日リズムの研究にccus、Ostreococcusへの関心の高まりは、バイオテクノロジーの領域を含む植物科学、内と外の多様な研究分野から期待することができます。保存された生化学的経路上で動作生物学および医学の広い範囲から研究者が大規模なモデル生物種のゲノムと生物複雑性から自由に、Ostreococcusの研究を追求すると考えるかもしれません。
細胞の状態や文化axenyは、変換手順については、非常に重要である。細胞は通常、光12時間のサイクルで維持されていますが、12時間暗、これらの条件下で培養した細胞の形質転換効率が不十分であることが判明した。繰り返しペレット化/再懸濁ステップ中に、細胞は常に容易に再懸濁する必要があります。細胞の集合体、あるいは粘液様物質が存在する場合は、再度最初から手順を開始することをお勧めします。通常は、〜50のコロニーがネガティブコントロールのプレート上なしと比べ、各形質転換プレートに期待することができます。低い形質転換効率の場合には、培養条件は細胞が最適な状態であることを確認するために変更する必要があります。形質転換効率に影響を与える変数は、周囲の研究室の温度(に近い20°Cなければなりません)と処理速度(ペレット化細胞からの手順[2.3]回復[2.7]〜1時間を取るべきであるから)が含まれています。それはまた重要であるすべてのソリューション再は、各変換の前に新鮮ました。プレートに含めるために、LMPアガロースの濃度が非常に重要です。Ostreococcus細胞が高いアガロース濃度で成長せず、低濃度で拡散します。
Ostreococcusの3つの形質転換ベクターは、以前6公開されており、より多くのベクトルが生成され、まもなく公開されることが期待されています。既存のベクトルポットリュック6 Potoxベクトル6 Ostreococcusから採取した強力な誘導13プロモーターを運ぶのに対し、高速なトランスジェニックラインの選択に加えて扱いやすいの発現パターンを可能にするC-末端ホタルルシフェラーゼタグとの組み合わせで、任意のプロモーターを使用することができます目的の遺伝子の過剰発現に対する高親和性リン酸トランスポーター(HAPT)遺伝子。 Potox-Lucのベクトルが過剰発現株の間接的な選択のために使用できる追加のルシフェラーゼマーカーを運ぶ、Potoxから派生<s14>まで。これらのベクトルに成功した選択マーカーはNourseothricinとG148があります。しかし、Ostreococcus細胞は多くの抗生物質に対して非常に耐性があり、トランスジェニックOstreococcus細胞の選択のために必要な化合物の濃度は、従来のモデルシステム(2 mg / ml)をより高くなっています。
プロセスが非効率に見えますが、この手順に必要な細胞とプラスミドDNAの大規模な数は有意な障害をもたらしません。大きな制限は、選択マーカーに耐性のあるすべての生成された行は、全体構造がDNAに組み込まれていることを確認するために個別に分析する必要があるということです。我々は、選択マーカーの正常な発現は、興味のある実際の遺伝子の挿入に対応していませんでした例を観察している、すなわち部分的な統合が発生する可能性があります。明らかに、ゲノムにランダムに挿入すると、このメソッドを使用して、挿入部位のないコントロールが存在しないことを意味し、メソッドB相同組換えにasedは、現在開発されています。しかし、ここで説明するメソッドは、現在、私たちの最善の知識に、遺伝子組み換えOstreococcus細胞を生成するための唯一の特徴とする方法である。
Ostreococcusタウリはごく最近の実験モデル生物として使用されているように、これらの細胞で働くほとんどのメソッドは進化する可能性があると関わって成長している研究コミュニティによって洗練される。このプロトコルは、人々がOstreococcusで作業を開始する際に役立ちますが、決してこの藻類のゲノム変換について知っているそこにあるすべてを説明するために主張されています。読者はインキュベーターの小さな違い(光のレベルまたは質)およびその他のパラメータが存在し、おそらくこのために必要な健康文化を得るためにすべての個々の研究室で最適化する必要がありますので、自分のニーズに合わせて、このプロトコルを適応させることができると著者らは、信頼プロトコル。マスタリング後の技術は、ここで説明するベクターは、プロモーターの範囲の制御下で発光、蛍光、またはその他のタグ融合行を生成するように構築することができます。このエキサイティングな新しい実験プラットフォームは、どのように複雑な生化学的な問題を勉強するために有用であろう薬理学的ア プローチは、非常に3を容易にされている、複雑さの低減の真核生物で解決されています。
The authors have nothing to disclose.
BBSRCとEPSRC賞D019621によって資金を供給統合システム生物学センターSynthSys。 FYBへエクセレンス "マリンゲノム"助成金EUのFP6ネットワークは、遺伝的形質転換法の開発に資金を提供しています。
Medium constituents | |||
Chemical | Catalogue number | Supplier | |
Instant Ocean Marine Salt | from amazon.co.uk or rocketaquatics.co.uk | ||
NaNO3 | S5506-250G | Sigma | |
NH4Cl | A9434-500G | Sigma | |
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | G9422-100G | Sigma | |
H2SeO3 | 84920-250G | Sigma | |
Ultra pure tris | 15504-020 | Invitrogen | |
Na2EDTA•2H2O | BPE120-500G | Fisher Scientific | |
FeCl3•6H2O | 157740 | Sigma | |
Na2MoO4•2H2O | 31439-100G-R | Sigma | |
ZnSO4•7H2O | Z0251 | Sigma | |
CoCl2•6H2O | 31277 | Sigma | |
MnCl2•4H2O | 203734-5G | Sigma | |
CuSO4•5H2O | C8027 | Sigma | |
Vitamin B12 (cyanocobalamin) | V2876 | Sigma | |
Biotin | 47868 | Sigma | |
Thiamine • HCl | T4625 | Sigma | |
Ampicillin | A9518-25G | Sigma | |
Neomycin | N6386 | Sigma | |
Kanamycin | K4000 | Sigma | |
Consumables for culturing | |||
Item | Catalogue number | Supplier | |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt | |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt | |
TPP Bottle top filters, 1L, complete | 99950T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 500ml, | 99500T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 250ml, | 99250T | Helena Bioscience | |
TPP Bottle top filters, 150ml, | 99150T | Helena Bioscience | |
Salinity Meter for Marine Aquarium | DSG-10 | Daeyoon |
Chemicals for transformation | ||
Chemical | Catalogue number | Supplier |
D-Sorbitol | S6021-1KG | Sigma |
Pluronic F-68 solution | P5556-100ML | Sigma |
ClonNat | 51000 | Werner |
Low melting point agarose | 16520-050 | Invitrogen |
Consumables for transformation | ||
Item | Catalogue number | Supplier |
Tissue Culture Flask T25 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1810.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T75 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1813.502 | Starstedt |
Tissue Culture Flask T175 Suspension Cultures Vented with Pouring Channel | 83.1812.502 | Starstedt |
Greiner centrifuge tubes 50ml | 227261 | GBO |
Gene Pulser/MicroPulser Cuvettes, 0.2 cm gap, 50 | 165-2086 | Bio-Rad |
Petri dish round PS 3 VENTS H14.2 Φ55 | 391-0895 | VWR International |
Petri dish square with four vents polystyrene sterile by irradiation clear 120mm | FB51788 | Fisher Scientific |
Moonlight Blue light filter | 183 | Lee Lighting |