Die Beurteilung der Replikation und Beta-Zellfunktion in adenoviral-transduzierten Isoliert Nager Islets
Summary
Dieses Protokoll erlaubt es, Faktoren, die funktionelle Betazellmasse modulieren, um potentielle therapeutische Ziele für die Behandlung von Diabetes zu finden identifizieren. Das Protokoll besteht aus einem optimierten Verfahren zur Insel Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratteninseln nach Manipulation der Genexpression mit Adenoviren zu beurteilen.
Abstract
Glukosehomöostase wird hauptsächlich durch die endokrine Hormone Insulin und Glucagon gesteuert, sekretiert von der Pankreas-Beta und Alpha-Zellen. Funktionelle Betazellmasse wird durch die anatomische Betazellmasse sowie der Fähigkeit der Betazellen zu einer Nährstoffbelastung reagieren bestimmt. Ein Verlust der funktionellen Betazellmasse ist zentral für beide Hauptformen des Diabetes 1-3. Während die sinkende funktionale Betazellmasse ergibt sich aus einer Autoimmun-Attacke beim Typ 1 Diabetes, bei Typ 2 Diabetes entwickelt sich dieser Dekrement sowohl aus der Unfähigkeit der Beta-Zellen gegenüber Insulin angemessen absondern und die Zerstörung der Beta-Zellen aus einem Kader von Mechanismen. Daher sind Bemühungen um eine funktionale Betazellmasse wieder vorrangig für die bessere Therapie und mögliche Heilmittel für Diabetes.
Es sind Bemühungen im Gange, um molekulare Signalwege, die ausgenutzt, um die Replikation zu stimulieren und verbessern die Funktion der Beta-Zellen identifizieren kann.Im Idealfall würde therapeutische Ziele verbessern sowohl Beta-Zell-Wachstum und Funktion. Vielleicht noch wichtiger ist jedoch zu erkennen, ob eine Strategie, die Beta-Zellen stimuliert das Wachstum auf Kosten der Beeinträchtigung der Beta-Zellen-Funktion (wie mit einigen Onkogene) und umgekehrt wird.
Durch die systematische Unterdrückung oder Überexpression der Expression von Zielgenen in isolierten Ratten-Inseln, kann man potenzielle therapeutische Ziele für die Erhöhung funktionale Betazellmasse 4-6. Adenovirus-Vektoren können, um effizient überexprimieren oder Knockdown Proteine in isolierten Ratteninseln 4,7-15 eingesetzt werden. Hier präsentieren wir eine Methode, um die Genexpression Nutzung adenoviralen Transduktion zu manipulieren und zu bewerten Inselchen Replikation und Beta-Zellfunktion in isolierten Ratten-Inseln (Abbildung 1). Diese Methode wurde bereits auf neue Ziele, die Beta-Zell-Vermehrung oder Funktion modulieren 5,6,8,9,16,17 zu identifizieren.
Protocol
Discussion
Einrichtung Wege, die moduliert werden, um die Replikation stimulieren und die Funktion der Beta-Zellen können relevant sind beiden Hauptformen von Diabetes. Da funktionale Betazellmasse ist abhängig von der Existenz und Funktion von Insulin-sezernierenden Zellen, die Beurteilung dieser Determinanten gleichzeitig hat seine Vorteile. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Protokoll zum Identifizieren, ob die Überexpression oder Unterdrückung eines Proteins an Veränderungen in der funktionellen Betazellmasse <em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von DK078732 Zuschuss von der NIH (bis PTF) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
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