Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores
Summary
Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.
Abstract
Homeostase da glucose é principalmente controlada pela insulina hormonas endócrinas e glucagon, secretada a partir da beta pancreáticas e células alfa, respectivamente. Massa celular funcional beta é determinado pela massa anatómica beta celular, bem como a capacidade das células beta para responder a uma carga de nutriente. Uma perda de massa funcional das células beta é central para ambas as formas principais de diabetes 1-3. Considerando que as declínio da capacidade funcional das células beta resultados de massa de um ataque auto-imune em pacientes com diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, este decréscimo se desenvolve tanto uma incapacidade das células beta a secretar insulina de forma apropriada e destruição das células beta de um quadro de mecanismos. Assim, os esforços para restabelecer a massa de células beta funcional são fundamentais para o melhor tratamento e possíveis curas para o diabetes.
Esforços estão em andamento para identificar caminhos moleculares que podem ser exploradas para estimular a replicação e melhorar a função das células beta.Idealmente, alvos terapêuticos iria melhorar tanto o crescimento das células beta e função. Talvez o mais importante é que para identificar se uma estratégia que estimula o crescimento das células beta está no custo da função das células beta prejudicando (tal como com alguns oncogenes) e vice-versa.
Sistematicamente suprimindo ou superexpressão de expressão de genes-alvo em ilhéus isolados de ratos, é possível identificar potenciais alvos terapêuticos para o aumento da massa funcional das células beta 4-6. Vectores adenovirais podem ser empregues para proteínas eficientemente superexpressam ou knockdown em ilhéus isolados de ratos 4,7-15. Aqui, nós apresentamos um método para manipular a expressão do gene utilizando transdução adenoviral e avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos (Figura 1). Este método tem sido utilizado anteriormente para identificar novos alvos que modulam a replicação das células beta ou função 5,6,8,9,16,17.
Protocol
Discussion
Vias, que estabelece que pode ser modulada para estimular a replicação e melhorar a função das células beta são relevantes para ambas as formas principais de diabetes. Devido massa celular funcional beta é dependente da existência e função de células secretoras de insulina, avaliando estes determinantes simultaneamente tem as suas vantagens. Este protocolo descreve um protocolo simplificado para identificar se a superexpressão ou supressão de uma proteína leva a alterações na massa funcional das células…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão DK078732 do NIH (a FPT).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
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