Çoğaltma ve Beta Hücre Fonksiyonu değerlendirilmesi Adenovirally-transdük İzole Kemirgen Islets
Summary
Bu protokol bir diyabet tedavisi için terapötik hedefleri bulmak için işlevsel beta hücre kitlesi modüle faktörleri belirlemek sağlar. Protokolü adenovirüsler ile gen ekspresyon manipülasyonu takiben izole sıçan adacıklarında adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için modern bir yöntem oluşur.
Abstract
Glikoz homeostazı, öncelikle, sırasıyla, pankreas beta ve alfa hücrelerden salgılanan, endokrin hormonlar insülin ve glukagon tarafından kontrol edilir. Fonksiyonel beta hücre kütlesi anatomik beta hücre kütlesi gibi bir besin yük yanıt beta hücrelerinin yeteneği ile belirlenir. Işlevsel beta hücre kitlesi kaybı diyabet 1-3 iki büyük formlar merkezidir. Tip 1 diyabetin otoimmün bir saldırı azalan işlevsel beta hücre kitlesi sonuçları ise, tip 2 diyabet, bu eksiltme uygun insülin salgılamaya beta hücrelerinin bir yetersizlik ve mekanizmalar bir kadro beta hücrelerinin yok hem de gelişir. Böylece, işlevsel beta hücre kitlesi geri çabaları daha iyi tedavi ve diyabet için potansiyel tedavileri için her şeyden vardır.
Çabaları çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için kullanılabilir moleküler yolları belirlemek için çalışmalar devam etmektedir.İdeal olarak, tedavi hedefleri beta hücre büyümesi ve fonksiyonu hem de artıracak. Ancak belki de daha önemli beta hücre büyümesini uyarır bir strateji zedeleyen beta hücre fonksiyonu (bazı onkogenler olduğu gibi) ve tam tersi pahasına geliyor olmadığını belirlemektir.
Izole sıçan adacıklar hedef genlerin sistematik baskılayarak veya aşırı ifadesi olarak, bir artan işlevsel beta hücre kitlesi 4-6 için potansiyel tedavi hedefleri belirleyebilir. Adenoviral vektörler izole sıçan adacıklar 4,7-15 verimli olarak artmış veya demonte proteinlerine istihdam edilebilir. Burada, adenoviral transdüksiyon kullanarak gen ekspresyon işlemek ve izole sıçan adacıklar (Şekil 1) adacık çoğaltma ve beta hücre fonksiyonu değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, beta hücre çoğaltma veya fonksiyon 5,6,8,9,16,17 modüle yeni hedefler belirlemek için daha önce kullanılmıştır.
Protocol
Discussion
Çoğaltma teşvik ve beta hücrelerinin işlevini geliştirmek için modüle olabilir kurulması yollarının her iki diyabet büyük formlar alakalı. Işlevsel beta hücre kitlesi bu belirleyicileri değerlendirmek, insülin salgılayan hücrelerin varlığı ve fonksiyonu bağlı olduğundan aynı anda avantajları vardır. Bu protokolün bir proteini aşırı ekspresyonu ya da bastırma sonra in vivo etki için test edilebilir in vitro olarak fonksiyonel beta hücre kütlesi değişikliklere yol a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (PTF kadar) hibe DK078732 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
Referências
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O’Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O’Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
