FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares
Summary
Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.
Abstract
Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía continúa ganando creciente interés como una técnica para la monitorización en tiempo real de eventos bioquímicos y de señalización en las células vivas y tejidos. En comparación con los métodos bioquímicos, esta nueva tecnología se caracteriza por una alta resolución temporal y espacial. FRET experimentos utilizar diversos genéticamente codificados con biosensores que pueden ser expresados y la imagen con el tiempo in situ o in vivo 1-2. Biosensores típicos pueden reportar interacciones proteína-proteína mediante la medición de FRET entre un par fluoróforo de etiquetado de proteínas o cambios conformacionales en una única proteína que alberga fluoróforos donante y aceptor interconectados con un resto de unión para una molécula de interés 3-4. Biosensores bimoleculares para las interacciones proteína-proteína incluyen, por ejemplo, construye diseñado para controlar la activación de la proteína G en las células 5, mientras que los sensores unimoleculares meamedida digital cambios conformacionales son ampliamente utilizados para mensajeros segunda imagen tales como calcio 6, cAMP 7-8, fosfatos de inositol 9 y cGMP 10-11. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes individuales de los componentes disponibles en el mercado y cómo controlar la configuración de todo el software gratuito con Micro-Manager. Este instrumento simple pero potente está diseñado para mediciones de rutina o más sofisticado FRET en células vivas. Imágenes obtenidas son procesadas usando auto-escrito plug-ins para visualizar los cambios en la relación de FRET en tiempo real durante todo experimento antes de ser almacenada en un formato de gráficos compatible con la construcción, en ImageJ software gratuito utilizado para el análisis posterior de los datos. Este sistema de bajo costo se caracteriza por una alta flexibilidad y puede ser utilizado con éxito para controlar varios eventos bioquímicos y moléculas de señalización por una plétora de biosensores disponibles FRET en células vivas y tejidos. Como un ejemplo, se demuestra hómo utilizar este sistema de imagen para realizar monitoreo en tiempo real de cAMP en células vivas de 293A a la estimulación con un agonista de los receptores β-adrenérgicos y bloqueantes.
Protocol
Discussion
en este protocolo, se demuestra cómo crear un simple y de bajo costo pero de gran alcance FRET sistema de imágenes para aplicaciones de rutina con una variedad de biosensores disponibles. El sistema que aquí se presenta está diseñado para PPC y YFP, o tipos similares de proteínas fluorescentes, como la pareja donante-aceptor. Mientras tanto, otros biosensores individuales estén disponibles que utilizan por ejemplo las proteínas fluorescentes verdes y rojas 14. Para adaptar el sistema descrito para otr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Anke Rüttgeroth Zimmermann y Karina de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención NI 1301/1-1 a VON) y la Universidad de Göttingen Medical Center ("pro futura" otorgamiento de VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
Referências
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