FRET Mikroskopi for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler Bruke Unimolecular biosensorer
Summary
Förster resonans energi overføring (FRET) mikroskopi er en kraftfull teknikk for sanntids overvåking av signalanlegg hendelser i levende celler ved hjelp av ulike biosensorer som journalister. Her beskriver vi hvordan du kan bygge en tilpasset epifluorescence FRET imaging system fra kommersielt tilgjengelige komponenter og hvordan du bruker den for FRET eksperimenter.
Abstract
Förster resonans energi overføring (FRET) mikroskopi fortsetter å vinne økende interesse som en teknikk for sanntids overvåking av biokjemiske og signalering hendelser i levende celler og vev. Sammenlignet med klassiske biokjemiske metoder, denne romanen teknologien preget av høy temporal og romlig oppløsning. FRET bruker eksperimenter ulike genetisk kodede biosensorer som kan uttrykkes og avbildes over tid in situ eller in vivo 1-2. Typiske biosensorer kan enten rapportere protein-protein interaksjoner ved å måle FRET mellom en fluorofor-merket par proteiner eller konformasjonsforandringer endringer i et enkelt protein som havner donor og akseptor fluoroforer innbyrdes forbundet med et bindende del for et molekyl av interesse 3-4. Bimolecular biosensorer for protein-protein interaksjoner omfatter f.eks, konstruerer utviklet for å overvåke G-protein aktivering i celler 5, mens de unimolecular sensorer measuring konformasjonsforandringer endringer er mye brukt til bilde andre budbringere som kalsium 6, 7-8 cAMP, xylanase 9 og cGMP 10-11. Her beskriver vi hvordan du kan bygge en tilpasset epifluorescence FRET imaging system fra enkle kommersielt tilgjengelige komponenter og hvordan å kontrollere hele oppsettet med Micro-Manager freeware. Denne enkle, men kraftige instrument er utformet for rutinemessig eller mer sofistikert FRET målinger i levende celler. Ervervet bilder er behandlet ved hjelp selvskrevet plug-ins for å visualisere endringer i FRET forholdet i sanntid i løpet av noen eksperimenter før de blir lagret i en grafikk format som er kompatibelt med den innebygde ImageJ freeware brukes for etterfølgende data analyse. Dette rimelige systemet er preget av høy fleksibilitet og kan med hell brukes til å overvåke ulike biokjemiske hendelser og signalmolekyler av en mengde tilgjengelig FRET biosensorer i levende celler og vev. Som et eksempel viser vi how å bruke dette bildesystem for å utføre sanntids overvåkning av cAMP i levende 293A celler upon stimulering med en β-adrenerg reseptoragonist og stopperen.
Protocol
Discussion
i denne protokollen, viser vi hvordan du kan bygge en enkel rimelig, men kraftig FRET imaging system for rutinemessig bruk med en rekke tilgjengelige biosensorer. Systemet som presenteres her er utformet for CFP og YFP eller lignende typer fluorescerende proteiner, som giver-akseptor par. Imens andre individuelle biosensorer blir tilgjengelige som bruker for eksempel grønne og røde fluoriserende proteiner 14. Å tilpasse den beskrevne systemet for andre farger, bør egnede lyskilder og / eller filter sett v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Anke Rüttgeroth og Karina Zimmermann for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskudd NI 1301/1-1 til VON) og University of Göttingen Medical Center ("pro futura" tilskudd til VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
Referências
- Zaccolo, M. Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ. Res. 94, 866-873 (2004).
- Mehta, S., Zhang, J. Reporting from the field: genetically encoded fluorescent reporters uncover signaling dynamics in living biological systems. Annu. Rev. Biochem. 80, 375-401 (2011).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 906-918 (2002).
- Miyawaki, A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev. Cell. 4, 295-305 (2003).
- Bunemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16077-16082 (2003).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J. Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Willoughby, D., Cooper, D. M. Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat. Methods. 5, 29-36 (2008).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Monitoring of cAMP synthesis and degradation in living cells. Physiology (Bethesda). 21, 86-92 (2006).
- Tanimura, A. Use of Fluorescence Resonance Energy Transfer-based Biosensors for the Quantitative Analysis of Inositol 1,4,5-Trisphosphate Dynamics in Calcium Oscillations. J. Biol. Chem. 284, 8910-8917 (2009).
- Nikolaev, V. O., Lohse, M. J. Novel techniques for real-time monitoring of cGMP in living cells. Handb. Exp. Pharmacol. , 229-243 (2009).
- Nausch, L. W., Ledoux, J., Bonev, A. D., Nelson, M. T., Dostmann, W. R. Differential patterning of cGMP in vascular smooth muscle cells revealed by single GFP-linked biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 365-370 (2008).
- Borner, S. FRET measurements of intracellular cAMP concentrations and cAMP analog permeability in intact cells. Nat. Protoc. 6, 427-438 (2011).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. J. Biol. Chem. 279, 37215-37218 (2004).
- Hong, K. P., Spitzer, N. C., Nicol, X. Improved molecular toolkit for cAMP studies in live cells. BMC Res. Notes. 4, 241-24 (2011).
- Niino, Y., Hotta, K., Oka, K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. PLoS One. 4, e6036 (2009).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat. Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Brumbaugh, J., Schleifenbaum, A., Stier, G., Sattler, M., Schultz, C. Single- and dual-parameter FRET kinase probes based on pleckstrin. Nat. Protoc. 1, 1044-1055 (2006).
- Aoki, K., Matsuda, M. Visualization of small GTPase activity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors. Nat. Protoc. 4, 1623-1631 (2009).
