يمكن أن يكون ELISA تحويلها بسهولة الى فحص xMAP Luminex و، من خلال الفوائد من الأجسام المضادة، ومضاعفة عدة يمكن عرضه في وقت واحد لتحديد هوية زوج الضد الأمثل، مما أدى إلى زيادة الحساسية ومجموعة ديناميكية، في حين خفض تكلفة الفحص.
كان فحص انزيم مرتبط المناعي (ELISA) لفترة طويلة الأداة الرئيسية للكشف عن من analytes من مصلحة في العينات البيولوجية لكل من الأبحاث والتشخيص السريري. ومع ذلك، ELISA له حدود. وعادة ما يتم تنفيذ ذلك في microplate 96-جيدا، والمغلفة الآبار مع الأجسام المضادة الطبيعية، التي تتطلب كمية كبيرة نسبيا من عينة لالتقاط مستضد من الفائدة. يمكن أن مساحة كبيرة من الآبار وملزم مسعور من الأجسام المضادة الطبيعية تؤدي أيضا إلى خلفية غير محددة ملزمة، وزيادة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم ELISAs الاعتماد على انزيم بوساطة تضخيم إشارة من أجل تحقيق حساسية معقولة. تضخيم هذه ليست دائما الخطية ويمكن لنتائج الانحراف وهكذا.
في السنوات ال 15 الماضية، برزت تقنية جديدة تقدم فوائد ELISA، ولكن أيضا تمكن أعلى من الناتج، وزيادة المرونة، وانخفاض حجم العينة، وانخفاض التكلفة، مع التعليم الجامعي مماثلةrkflow 1 و 2. Luminex xMAP التكنولوجيا هي منصة microsphere الصفيف (حبة) تمكين كل من monoplex وفحوصات متعددة والتي يمكن تطبيقها على كل من البروتين وتطبيقات الحمض النووي 3-5. حبات لديهم الأجسام المضادة يجمد تساهمي القبض على أصغر مساحة السطح، وتتطلب قدرا أقل من الأجسام المضادة الطبيعية، وأحجام أصغر العينة مقارنة مع إليسا، وغير محدد وملزم انخفاضا كبيرا. حجم أصغر عينة مهمة عند التعامل مع العينات الحد من مثل السائل المخي الشوكي، السائل الزليلي، الخ 6. الإرسال المتعدد الفحص يقلل من متطلبات حجم العينة، وتمكين نتائج متعددة من عينة واحدة.
التحسن الذي طرأ مؤخرا من قبل Luminex ما يلي: نظام MAGPIX جديدة، أصغر حجما، وأقل تكلفة وأسهل للاستخدام محلل؛ منخفضة التركيز المغناطيسي MagPlex المجهرية التي تلغي الحاجة إلى لوحات مرشح مكلفة وتأتي في تركيز عمل أكثر ملاءمة للتنمية وفحصمنخفضة الإنتاجية التطبيقات، واقتران جسم xMAP مجموعة (اي بي سي)، والذي يتضمن بروتوكول والكواشف والمواد الاستهلاكية الضرورية للاقتران حبات لالتقاط الاجسام المضادة للاهتمام. (راجع المواد قسم للحصول على قائمة مفصلة من محتويات عدة.)
في هذه التجربة، ونحن تحويل فحص ELISA قبل الأمثل لTNF-ألفا خلوى إلى منصة xMAP ومقارنة أداء الطريقتين 7-11. TNF-alpha عبارة عن العلامات البيولوجية المستخدمة في قياس الاستجابات الالتهابية في المرضى الذين يعانون من اضطرابات المناعة الذاتية.
نبدأ من قبل اقتران أربعة أجسام مضادة والقبض على مرشح لأربع مجموعات microsphere أو مناطق مختلفة. عندما مختلطة معا، وهذه المجموعات الأربع تسمح للاختبار في وقت واحد من جميع المرشحين الأربعة مع أربعة أجسام مضادة كشف منفصل لتحديد هذا الزوج أفضل الأجسام المضادة، الكواشف الادخار، وعينة والوقت. هي التي شيدت بعد ذلك اثنين من المقايسات xMAP مع اثنين ازواج الضد الأمثل والأكثر من أدائهامقارنة بما كان عليه من فحص ELISA الأصلية في ما يخص قوة الإشارة، ومجموعة ديناميكية، والحساسية.
ويمكن تحويل لفحص ELISA إلى منصة xMAP Luminex ان تكون بسيطة مثل استبدال streptavidin الفجل البيروكسيديز (SA-HRP) في مجموعة ELISA نموذجي مع فيكوإيريترين streptavidin (SA-PE)، وتحسين الأداء. لأولئك الذين يريدون لإنشاء المناعية xMAP من الألف إلى الياء، ويمكن تحقيق ذلك مع بروتوكول واضحة أن تمكن أيضا من تقييم سريع متعددة، من أزواج الأضداد. وأعدت بسهولة الكواشف لفحص xMAP استخدام عدة جسم xMAP اقتران الزوجين إلى الأجسام المضادة المحددة لالتقاط MagPlex المجهرية تركيز منخفض. استخدام المجهرية التركيز المنخفض يقلل من تكلفة تطوير فحص في الوقت الذي توفر أداء الفحص نفسه من المجهرية تركيز أعلى. مقدار الوقت اللازم لإعداد يقترن MagPlex المجهرية ما يقرب من 3 ساعات، وهو أسرع بكثير من ال 22 – 24 ساعة المطلوبة لمعطف جيد من لوحة ELISA، تليها معاملةمن الآبار المغلفة. أداء فحص xMAP أيضا متفوقة على إليسا من حيث الحد من كشف (<4 بيكوغرام / مل مقابل> جزء من الغرام / مل 31) مجموعة والديناميكية (<4 بيكوغرام / مل إلى> 8000 جزء من الغرام / مل مقابل 16 جزء من الغرام / مل إلى 1000 جزء من الغرام / مل). القراء لوحة لديها مجموعة والتطوير التنظيمي المحدودة التي هي إما 3 أو 4 التطوير التنظيمي، وتقييد الحد الأعلى من النطاق الديناميكي للحصول على فحص.
مما لا شك فيه، وليس كل الأجسام المضادة تعمل في شكل ELISA وليس كل الأجسام المضادة التي تعمل بشكل جيد في ELISA يمكن نقلها بسهولة إلى تنسيق فحص xMAP. ومع ذلك، نظرا لأنه يمكن المضاعفة المقايسات xMAP (أي تشغيل في نفس الوقت)، فمن الممكن لتقييم القبض على عدة مجموعات وكشف الأجسام المضادة في وقت واحد لتحديد أفضل زوج لاستخدام لفحص. هذه العملية يوفر وقتا كبيرا والكواشف بالمقارنة مع إجراء تطوير ELISA، والذي يقتصر على تقييم من زوج واحد في وقت واحد. وينبغي أن أزواج الأضداد اثنين أو أكثر من أداء مكافئ؛ المعلمات الأخرى للفحص يمكنينبغي النظر لتحديد مدى ملاءمتها للزوج (على سبيل المثال، وتوافر، والتكلفة، وما إلى ذلك).
بالإضافة إلى فحص أداء أفضل ومرونة مع مقايسة xMAP، وهناك أيضا وفورات كبيرة في التكاليف. الكمية الموصى بها من الأجسام المضادة اللازمة لمعطف بئر واحدة من لوحة ELISA هو 400ng، في حين أن الكمية المطلوبة لالخرز المستخدمة في بئر واحدة لفحص xMAP هو ما يقرب من 7.5 نانوغرام. وبالتالي، فإن كمية من الأجسام المضادة اللازمة لأحد ELISA سوف توفر كذلك نتائج الاختبار أكثر من 50 عاما، إذا ما استخدمت في فحص xMAP. للتطبيقات التي تنطوي على العينات الثمينة، xMAP أيضا لديه ميزة كبيرة. حجم عينة الموصى بها لإليسا هو 100 ميكروليتر في حين أن حجم اللازمة لفحص xMAP يمكن أن يكون نصف هذا، أو أقل.
في ملخص، وتحويل لفحص ELISA إلى منصة xMAP Luminex هو غير معقدة والكفاءة وتوفير التكاليف، في حين أن انتاج مقايسة مع مجموعة ديناميكية متفوقة وحساسية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل شركة Luminex.
Description | Vendor | Catalogue Number | Comments |
Human TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA kit | R & D Systems | DY210 | Includes monoclonal and biotin coupled polyclonal antibodies and recombinant TNF-α protein standard |
Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab18696 | Capture Antibody, clone CH8820 |
Monoclonal Antibody to TNF-α | Abcam | Ab16166 | Biotin coupled Detection Antibody, clone AS1 |
TNF alpha protein | Abcam | Ab9642 | Recombinant TNF-α protein standard |
Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NBP1-50115 | Capture Antibody, clone 4H31 |
Monoclonal Antibody to TNF-α | Novus | NB100-78162 | Biotin coupled Detection Antibody, clone MAb11 |
TNF alpha protein | Novus | NBC1-18460 | Recombinant TNF-α protein standard |
Monoclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | MAB1141 | Capture Antibody, clone 3C7.2 |
Polyclonal Antibody to TNF-α | EMD Millipore | 654250 | Rabbit polyclonal Detection Antibody |
Streptavidin-Phycoerythrin | Moss | SAPE-001 | Fluorescent reporter reagent for Luminex xMAP Assay |
MAGPIX w/ xPONENT Software | Luminex Corporation | MAGPIX-XPONENT | Luminex Instrument |
xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | Includes EDC reagent, Sulfo-NHS reagent, activation buffer, wash buffer, 1.5 mL reaction tubes, and disposable pipettes |
MagPlex Microspheres, Low Concentration | Luminex Corporation | MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID | Low concentration beads (@ 2.5 x 106 bead/mL) |
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher | PI-21335 | Biotinylation kit for unmodified detection antibody |
Tecan Infinite F200 Reader | Tecan | ELISA plate reader | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P-3688 | 1% PBS-BSA, Assay Buffer |
One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner, 115 VAC | Cole-Parmer | WU-08849-00 | Produce an effective operating frequency of 55 kHz |
Magnetic Tube Separator | Luminex Corporation | CN-0288-01 | For single 1.5mL tube magnetic separation in coupling wash steps |
Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | For 96-well plate magnetic separation in assay wash steps |