יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em> ג elegans</em
Summary
נייר עמדה זה מפרט כיצד להשתמש רציפה הזרימה לתאי חוסר חמצן כדי ליצור אווירה עם ריכוזים מוגדרים של O<sub> 2</sub> להבין תגובות ביולוגיות לירידה O<sub> 2</sub>. מערכת זו קל להתקנה ולתחזוקה, גמישים מספיק כדי להתאים מגוון רחב של O<sub> 2</sub> ריכוז ומערכות מודל
Abstract
חמצן חיוני metazoans כל לשרוד, עם חריג אחד ידוע 1. ירידה O 2 זמינות (היפוקסיה) יכולים להיווצר במהלך מצבים של התפתחות המחלה, רגיל או שינויים בתנאי הסביבה 2-5. הבנת מסלולי איתות תאיים המעורבים בתגובה ל היפוקסיה יכול לספק תובנה חדשה אסטרטגיות טיפול של מחלות אנושיות שונות, משבץ לסרטן. מטרה זו כבר הקשתה, לפחות בחלקה, בשל קשיים טכניים הקשורים עם חשיפה מבוקרת hypoxic באורגניזמים מודל מקובל מבחינה גנטית.
Caenorhabditis elegans את נמטודות הוא אידיאלי כאורגניזם מודל לחקר בתגובה חוסר חמצן, כפי שהוא קל תרבות גנטית לתפעל. יתר על כן, ניתן ללמוד התגובות הסלולר ספציפיים חוסר חמצן O 2 בריכוזים ללא תופעות מבלבלים מאז ג elegans להשיג O 2 (ו גזים אחרים) על ידי דיפוזיה, בניגוד למערכת הנשימה הקל 6. גורמים הידועים כמעורבים בתגובה ל היפוקסיה שמורים ב C. elegans. תגובה ממשית היפוקסיה תלויה בריכוז מסוים של O 2 הזמין. ב C. elegans, חשיפה מתונה היפוקסיה מעורר תגובה תעתיק מתווכת במידה רבה על ידי HIF-1, את הפערים המשתמרים היפוקסיה, גורם שעתוק מושרה 6-9. ג. עוברים elegans דורשים HIF-1 לשרוד עמודים לדקה 5,000-20,000 O 2 7,10 . היפוקסיה היא מונח כללי של "פחות מ רגיל 2". Normoxia (רגיל O 2) יכול להיות גם קשה להגדיר. בדרך כלל אנחנו רואים האוויר בחדר, שהיא 210,000 עמודים לדקה O 2 להיות normoxia. עם זאת, הוכח כי ג elegans יש העדפה התנהגותי עבור O 2 בריכוזים של 5-12% (50,000-120,000 עמודים לדקה O 2) 11. ב Larvae ומבוגרים, HIF-1 פעולות כדי למנוע היפוקסיה-Induced diapause בשנת 5000 ppm O 2 12. עם זאת, HIF-1 אינו משחק תפקיד בתגובה לריכוזים נמוכים יותר של O 2 (anoxia, הגדרה תפעולית <10 עמודים לדקה O 2) 13. ב anoxia, C. elegans נכנס למצב של חיות מושהית הפיך שבו כל פעילות הנצפה במיקרוסקופ מפסיק 10. העובדה כי התגובות הפיזיולוגיות השונות להתרחש בתנאים שונים מדגיש את החשיבות של בעל השליטה ניסיוני על ריכוז של חוסר חמצן O 2.
כאן, אנו מציגים שיטה לבנייה ויישום של תאים המייצרים תנאים סביבתיים hypoxic אמין לשחזור עם ריכוזים מוגדרים של O 2. שיטת הזרימה המתמשכת מבטיחה איזון מהיר של החדר ומגביר את היציבות של המערכת. בנוסף, שקיפותהנגישות של החדרים לאפשר ראיה ישירה של בעלי חיים שנחשפו היפוקסיה. בנוסף, אנו מדגימים שיטה יעילה של קצירת ג elegans דגימות במהירות לאחר חשיפה היפוקסיה, אשר יש צורך לבחון רבים במהירות, מהופכים השינויים המתרחשים 10,14 היפוקסיה. שיטה זו מספקת תשתית בסיסית כי ניתן לשנות בקלות עבור הצרכים מעבדה נפרדים, כולל מערכות מודל שונות ועוד מגוון של גזים.
Protocol
Discussion
שיטה זו מהווה אסטרטגיה לבניית סביבה hypoxic המאפשר לסביבות עם ריכוזים מדויקים של חמצן להישמר במעבדה. לשכות אלה מספקים שיטה פשוטה חשיפת אורגניזמים בריכוזים נמוכים ספציפיים של O 2 וניטור התפוקות מולקולריות ופיזיולוגיות. החדר הסביבה תיאר מורכב על ידי המעבדה במקום לר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי המעבדה מילר לדיון קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי בפרס החוקר חדש מהמרכז הלם נתן למצוינות הביולוגיה הבסיסית של הזדקנות ל DLM לבין המכון הלאומי לבריאות הפרס R00 AG030550 כדי DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
Referências
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Pesquisa do Câncer. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. . Oxygen Sensing. 381, (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
