Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em> C. elegans</em
Summary
O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı ayrıntıları<sub> 2</sub> Biyolojik tepkileri anlamak için O azalmış<sub> 2</sub>. Bu sistem kurulumu ve bakımı kolay, ve O geniş bir yelpazede uyacak kadar esnektir<sub> 2</sub> Konsantrasyonları ve model sistemler
Abstract
Tüm metazoans tek bilinen istisnası 1, yaşaması için oksijen çok önemlidir. Azalmış O 2 durumunu (hipoksi) hastalığı, normal gelişim ve çevresel koşullarda 2-5 değişikliklerin devletlerin sırasında ortaya çıkabilir. Hipoksiye yanıt olarak katılan hücresel sinyal yollarının anlaşılması inme kansere kadar, çeşitli insan patolojiler için tedavi stratejileri hakkında yeni ipuçları sağlayabilir. Bu amaç, genetik olarak müsait modeli organizmalarda kontrollü hipoksik maruz kalma ile bağlantılı teknik zorluklar göre, en azından kısmen, büyük ölçüde azalmıştır.
Nematod Caenorhabditis elegans ideal bir kültür kolaydır ve genetik olarak manipüle olarak, hipoksik yanıt çalışmaları için bir model organizma olarak uygundur. Ayrıca, C. yana karıştırıcı etkisi olmadan belirli hipoksik O 2 konsantrasyonları hücresel yanıtları incelemek mümkündür elegans O 2 (eldeve difüzyon ile diğer gazlar) gibi bir kolaylaştırılmış solunum sistemi 6. karşı. Hipoksiye yanıt olarak dahil olmak üzere bilinen faktörleri C'de muhafaza edilmektedir elegans. Hipoksiye gerçek cevap mevcuttur O 2 spesifik konsantrasyonuna bağlıdır. C. elegans, hipoksi orta maruz hif-1 tarafından büyük ölçüde aracılık ettiği bir transkripsiyonel yanıt verilmesini sağlar, yüksek korunmuş hipoksi-indüklenebilir transkripsiyon faktörü 6-9. C. elegans embriyo O 2 7,10 5,000-20,000 ppm hayatta kalmak için hif-1 gerektirir . Hipoksi "normal O 2 daha az" için genel bir terimdir. Normoksi (normal O 2) de tarif etmek zor olabilir. Biz genellikle normoksi olması 210,000 ppm O 2 oda havası, düşünün. Bununla birlikte, bu gösterilmiş olduğu C. elegans% 5-12 arası O 2 konsantrasyonları (ppm 50,000-120,000 O 2) 11 için davranışsal bir tercihi vardır. Larvae ve yetişkinler, 5.000 ppm O 2 12 hipoksi bağlı diapause önlemek için hif-1 davranır. Ancak, hif-1 O 2 'nin düşük konsantrasyonlarda (anoksi, operasyonel tanım <10 ppm O 2) 13 yanıt olarak bir rol oynamıyor. Anoksi, C. elegans tüm mikroskobik gözlemlenebilir etkinliği 10 sona erdiği asılı animasyon tersinir bir duruma geçer. Farklı koşullarda farklı fizyolojik tepkiler meydana gerçeği O 2 hipoksik konsantrasyonu üzerinde deney kontrolü olmasının önemini vurgulamaktadır.
Burada, O 2 tanımlanmış konsantrasyonlarını güvenilir ve tekrarlanabilir hipoksik koşullarda üretmek çevre odalarının yapımı ve uygulanması için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli bir akış yöntemi haznesinin hızlı dengeleme sistemi sağlar ve stabilitesini arttırır. Ayrıca, şeffaflık veodalarının erişilebilirlik hipoksiye maruz hayvanların doğrudan görselleştirme için izin verir. Biz daha C. hasat etkili bir yöntem gösterilmektedir elegans örnekleri hızla hipoksi maruz kaldıktan sonra, bu hipoksi 10,14 meydana hızla-ters değişiklikleri birçok gözlemlemek için gereklidir. Bu yöntem, kolayca farklı model sistemler ve gazlar çeşitli dahil bireysel laboratuar ihtiyaçları için değiştirilebilir temel bir temel sağlar.
Protocol
Discussion
Bu yöntem, laboratuvarda muhafaza edilecek oksijen konsantrasyonları hassas ortamlar için izin veren bir hipoksik ortam oluşturmak için bir strateji sunar. Bu odaların O 2 özel düşük konsantrasyonda organizmalar teşhir ve moleküler ve fizyolojik çıkışları izlemek için basit bir yöntem sağlar. Açıklanan çevre odası laboratuar yerine ticari olarak satın tarafından birleştirilir ve böylece deney ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir.
Bu yönte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tartışma ve yazının eleştirel okuma için Miller laboratuar üyeleri teşekkür ederim. Bu çalışma DLM ve DLM Sağlık ödülü R00 AG030550 National Institutes of Aging için Temel Biyoloji Mükemmellik Nathan Şok Merkezi'nden yeni bir araştırmacı ödül tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
References
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. . Oxygen Sensing. 381, (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
