Automatiseret Kvantificering af Synaptic Fluorescens in<em> C. elegans</em
Summary
Den overflod af neurotransmitter receptorer klynger på synapser stærk indflydelse synaptisk styrke. Denne fremgangsmåde kvantificerer fluorescens-mærkede neurotransmitterreceptorer i tre dimensioner med en enkelt-synapse opløsning i<em> C. elegans</em>, Så hundredvis af synapser, at der hurtigt karakteriseres i en enkelt prøve uden forvridninger indført ved z-plan projektion.
Abstract
Synapse styrke refererer til amplituden af postsynaptiske responser på præsynaptiske neurotransmitterfrigivelse begivenheder, og har en stor indvirkning på den samlede neurale kredsløb funktion. Synapse styrke kritisk afhænger af den overflod af neurotransmitter receptorer klynger på synaptiske steder på den postsynaptiske membran. Receptorniveauer er etableret udviklingsmæssigt, og kan ændres ved hjælp af receptor handel mellem overflade-lokaliseret, subsynaptic og intracellulære pools, der repræsenterer vigtige mekanismer af synaptisk plasticitet og neuromodulation. Strenge metoder til at kvantificere synaptisk-lokaliserede neurotransmitterreceptor overflod er afgørende for at studere synaptisk udvikling og plasticitet. Fluorescens mikroskopi er en optimal tilgang, fordi det bevarer geografisk information, skelne synaptisk fra ikke-synaptiske pools, og at skelne mellem receptor befolkninger lokaliseret til forskellige typer af synapser. Den genetiske modelorganisme Caenorhabditis elegans er særlig velegnet til disse undersøgelser på grund af lille størrelse og relative enkelhed af nervesystemet, gennemsigtighed, og tilgængeligheden af stærke genetiske teknikker, der tillader undersøgelse af native synapser i intakte dyr.
Her præsenterer en fremgangsmåde til kvantificering af fluorescens-mærkede synaptiske neurotransmitterreceptorer i C. elegans. Dens primære funktion er automatiseret identifikation og analyse af enkelte synapser i tre dimensioner i multi-fly konfokal mikroskop output filer, tabulating position, volumen, fluorescensintensitet, og den samlede fluorescens for hver synapse. Denne fremgangsmåde har to vigtige fordele i forhold manuel analyse af z-plane fremspring af konfokale data. Først, fordi hver planet for konfokal datasæt er inkluderet, er der ingen data går tabt gennem z-plan projektion, typisk baseret på pixelintensitetsniveauerne gennemsnit eller maxima. For det andet, identifikation af synapser er automatiseret, men kan kontrolleres af den færdigeperimenter som dataanalyse udbytte, tillader hurtig og nøjagtig ekstraktion af data fra et stort antal af synapser. Hundredvis til tusindvis af synapser pr prøve kan let opnås, der producerer store datasæt for at maksimere statistisk styrke. Overvejelser til forberedelse C. elegans til analyse, og udførelse af konfokal billeddannelse at minimere variabilitet mellem dyr i behandlingsgrupperne er også diskuteret. Selv udviklet til analyse C. elegans postsynaptiske receptorer, denne metode er generelt anvendelig for alle typer af synaptisk-lokaliseret protein eller endog en fluorescens-signal, der er lokaliseret til diskrete klynger, puncta eller organeller.
Fremgangsmåden udføres i tre trin: 1) fremstilling af prøver, 2) konfokal billeddannelse, og 3) billedanalyse. Trin 1 og 2 er specifikke for C. elegans, mens trin 3 er generelt gældende for alle punktformet fluorescens signalet i konfokal mikrografer.
Protocol
Discussion
Metoden præsenteres her, er designet til at udtrække kvantitative multi-parameter data for store populationer af synapser i C. elegans, og samtidig maksimere konsistens inden for behandlingsgrupper. Tre funktioner bidrager til disse mål. Først immunfarvning udføres på synkrone snekkegear befolkninger at sikre, at alle dyr er den samme alder. Dette trin er kritisk på grund udviklingsmæssig regulering af ekspressionsniveauer kan tilsløre virkninger eksperimentel behandling (f.eks UNC-49 GABA-receptor imm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke A. Benham for at hjælpe med udviklingen af protokollen. Dette arbejde blev finansieret af NIH tilskud NS06747 til BAB
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. |
Referências
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
