Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em> C elegans</em

Summary

Die Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an den Synapsen stark beeinflusst geclusterten synaptischen Stärke. Diese Methode quantifiziert fluoreszenzmarkierten Neurotransmitter-Rezeptoren in drei Dimensionen mit Single-Auflösung in Synapsen<em> C elegans</em>, So dass Hunderte von Synapsen zu schnell innerhalb einer einzigen Probe, ohne Verzerrungen, die durch z-Ebene Projektion eingeführt wird.

Abstract

Synapse Stärke bezieht sich auf die Amplitude des postsynaptischen Antworten auf präsynaptische Freisetzung von Neurotransmittern Ereignisse, und hat einen großen Einfluss auf die Gesamt-neuronalen Schaltkreis-Funktion. Synapse Stärke hängt entscheidend von der Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an Synapsen auf der postsynaptischen Membran gruppierten. Rezeptor-Ebenen sind entwicklungsgeschichtlich, etabliert und kann durch Rezeptortransport zwischen Oberflächen-lokalisierten, subsynaptischen und intrazellulären Pools, die für wichtige Mechanismen der synaptischen Plastizität und Neuromodulation verändert werden. Rigorosen Methoden zur synaptisch-lokalisierte Neurotransmitter-Rezeptor Fülle quantifizieren sind unerlässlich, um synaptischen Entwicklung und Plastizität zu studieren. Die Fluoreszenzmikroskopie ist optimal, weil es räumliche Information erhält, unterscheiden synaptischen aus nicht-synaptischen Pools und Unterscheiden zwischen Rezeptorpopulationen lokalisiert, um verschiedene Arten von Synapsen. Die genetischen Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist besonders gut für diese Studien aufgrund der geringen Größe und der relativen Einfachheit seines Nervensystems, seine Transparenz, und die Verfügbarkeit von leistungsfähigen genetischen Techniken geeignet und ermöglicht Untersuchung der nativen Synapsen in intakten Tieren.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Neurotransmitter-Rezeptoren in C. elegans. Sein wesentliches Merkmal ist die automatisierte Identifikation und Analyse einzelner Synapsen in drei Dimensionen in mehreren Ebenen konfokalen Mikroskop Ausgabedateien, Tabellieren Position, Volumen, Intensität der Fluoreszenz, Fluoreszenz und insgesamt für jede Synapse. Dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber der manuellen Analyse der z-Ebene konfokale Projektionen von Daten. Erstens, weil jede Ebene des konfokalen Datensatz enthalten ist, werden keine Daten über z-Ebene Projektion verloren, in der Regel auf Pixelintensität Durchschnitte oder Maxima basiert. Zweitens Identifizierung von Synapsen automatisiert ist, aber durch die ex überprüft werdenperimenter wie die Datenanalyse geht, so dass eine schnelle und genaue Extrahierung von Daten aus einer großen Anzahl von Synapsen. Hunderte bis Tausende von Synapsen pro Probe leicht erhalten werden, produzieren große Datensätze statistische Energie zu maximieren. Überlegungen zur Vorbereitung C. elegans zur Analyse und Durchführung konfokale Bildgebung an Variabilität zwischen den Tieren innerhalb Behandlungsgruppen zu minimieren werden ebenfalls diskutiert. Zwar entwickelt, um C zu analysieren elegans postsynaptischen Rezeptoren, ist dieses Verfahren im Allgemeinen für jede Art von synaptisch-lokalisierten Protein oder Tat, einem Fluoreszenz-Signal, das diskrete Cluster, Punkte oder Organellen lokalisiert ist nützlich.

Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1) Herstellung von Proben, 2) konfokale Abbildung, und 3) Bildanalyse. Schritt 1 und 2 sind spezifisch für C elegans, und Stufe 3 ist allgemein anwendbar auf jede punktförmige Fluoreszenz-Signal in der konfokalen Aufnahmen.

Protocol

1. Preparation of Worms for Imaging This segment of the protocol is based on published C. elegans culture techniques1,2, and is outlined in Figure 1. Grow worms on high peptone NGM agar plates (10 cm) seeded with NA22 E. coli bacteria until nearly starved. If immunostaining, one plate will reliably produce enough worms for 1 individual stain, taking into account losses along the way, and the strict criteria used to select worms for imag…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um quantitative Multi-Parameter-Daten für große Populationen von Synapsen in C extrahieren elegans, bei gleichzeitiger Maximierung der Konsistenz innerhalb Behandlungsgruppen. Drei Merkmale tragen zu diesen Zielen. Zunächst wird Immunfärbung auf synchrone Wurm Populationen durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle Tiere gleich alt sind. Dieser Schritt ist wichtig, weil Entwicklungs-Regulierung der Expression Effekte der experimentellen Behandlung z…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.