Automatisert Kvantifisering av Synaptic fluorescens i<em> C. elegans</em

Summary

Overflod av nevrotransmitterreseptorer grupperte ved synapser påvirker sterkt synaptiske styrke. Denne metoden kvantifiserer fluorescently-merket nevrotransmitterreseptorer i tre dimensjoner med single-synapse oppløsning i<em> C. elegans</em>, Slik at hundrevis av synapser å bli raskt karakterisert innenfor en enkelt prøve uten forvrengninger introdusert av z-planet projeksjon.

Abstract

Synapse styrke refererer til amplituden postsynaptiske responser til presynaptiske neurotransmitterfrigivning arrangementer, og har en stor innvirkning på den samlede nevrale krets funksjon. Synapse styrke avhenger kritisk av overflod av nevrotransmitterreseptorer grupperte på synaptiske steder på postsynaptisk membran. Reseptor nivåer er etablert utviklingshemmede, og kan endres av reseptor trafficking mellom overflate-lokalisert, subsynaptic, og intracellulær bassenger, som representerer viktige mekanismer for synaptisk plastisitet og neuromodulation. Strenge metoder for å kvantifisere synaptically-lokalisert nevrotransmitter reseptorer overflod er viktig å studere synaptisk utvikling og plastisitet. Fluorescens mikroskopi er en optimal tilnærming fordi det bevarer romlig informasjon, skille synaptic fra ikke-synaptiske bassenger, og diskriminere blant reseptor populasjoner lokalisert til forskjellige typer synapser. Den genetiske modell organisme Caenorhabditis elegans er spesielt godt egnet for disse studiene på grunn av liten størrelse og relativ enkelhet av sitt nervesystem, sin åpenhet, og tilgjengeligheten av kraftige genetiske teknikker, slik at undersøkelse av innfødte synapser i intakte dyr.

Her presenterer vi en metode for å kvantifisere fluorescently-merket synaptiske nevrotransmitterreseptorer i C. elegans. Dens viktig funksjon er automatisk identifisering og analyse av individuelle synapser i tre dimensjoner i multi-plane confocal mikroskop utdatafiler, tabulerer posisjon, volum, fluorescens intensitet, og total fluorescens for hver synapse. Denne tilnærmingen har to vesentlige fordeler fremfor manuell analyse av z-planet projeksjoner av confocal data. Først fordi hver planet av confocal datasettet er inkludert, er ingen data tapt gjennom z-planet projeksjon, typisk basert på pikselintensiteten gjennomsnittsverdier eller maxima. Second, identifisering av synapser er automatisert, men kan inspiseres av experimenter som dataanalysen inntektene, slik at rask og nøyaktig uttak av data fra et stort antall synapser. Hundrevis til tusenvis av synapser per sample kan enkelt oppnås, produsere store datasett for å maksimere statistisk styrke. Hensyn for utarbeidelse C. elegans for analyse, og utføre confocal bildebehandling for å minimere variasjonen mellom dyr innenfor behandlingsgruppene blir også diskutert. Selv utviklet for å analysere C. elegans postsynaptiske reseptorer, er denne metoden generelt nyttig for enhver type synaptically-lokalisert protein, eller faktisk, noen fluorescens signal som er lokalisert til diskrete klynger, puncta eller organeller.

Prosedyren utføres i tre trinn: 1) forberedelse av prøvene, 2) confocal bildebehandling, og 3) bildeanalyse. Trinn 1 og 2 er spesifikke for C. elegans, mens trinn 3 er generelt gjelder til enhver punctate fluorescens signal i confocal mikrografer.

Protocol

1. Utarbeidelse av Worms for Imaging Dette segmentet av protokollen er basert på offentlig C. elegans kultur teknikker 1,2, og er skissert i figur 1. Grow ormer på høye Peptone NGM agar plater (10 cm) seeded med NA22 E. coli-bakterier før nesten sultet. Hvis farging, vil en plate pålitelig produsere nok mark til en individuell flekken, tar hensyn til tap underveis, og de strenge kriteriene som brukes for å velge ormer for bildebe…

Discussion

Metoden som presenteres her er utformet for å trekke kvantitative multi-Parameterdataene for store bestander av synapser i C. elegans, samtidig maksimere konsistens i behandlingsgruppene. Tre funksjoner bidra til disse målene. Først blir farging utføres på synkrone ormen populasjoner for å sikre at alle dyr er like gamle. Dette trinnet er kritisk fordi utviklingsmessig regulering av uttrykk nivåer kan tilsløre virkningene av den eksperimentelle behandlingen (f.eks UNC-49 GABA receptor immunfluorescens v…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.