La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em> C. elegans</em

Summary

La abundancia de receptores de neurotransmisores en las sinapsis agrupadas influye fuertemente en la fuerza sináptica. Este método cuantifica marcadas con fluorescencia receptores de neurotransmisores en tres dimensiones con una sola sinapsis resolución en<em> C. elegans</em>, Permitiendo cientos de sinapsis que se caracteriza rápidamente dentro de una sola muestra sin distorsiones introducidas por proyección plano z.

Abstract

Fuerza de la sinapsis se refiere a la amplitud de las respuestas postsinápticas a la liberación de neurotransmisores presinápticos eventos, y tiene un gran impacto en la función global de circuitos neuronales. Fuerza de la sinapsis depende fundamentalmente de la abundancia de receptores de neurotransmisores sinápticos agrupados en los sitios en la membrana postsináptica. Los niveles del receptor se estableció el desarrollo, y pueden ser alterados por el tráfico de receptores entre los depósitos de superficie localizada, subsináptica, e intracelular, lo que representa un importante mecanismo de plasticidad sináptica y la neuromodulación. Rigurosos métodos para cuantificar la abundancia sinápticamente localizado receptores de neurotransmisores son esenciales para estudiar el desarrollo y la plasticidad sináptica. La microscopia de fluorescencia es un método óptimo, ya que preserva la información espacial, distinguiendo sináptica de la no-sinápticas piscinas, y discriminar entre las poblaciones de los receptores localizados en diferentes tipos de sinapsis. El organismo modelo Caenorhabditis genética elegans es especialmente adecuado para estos estudios debido al pequeño tamaño y relativa simplicidad de su sistema nervioso, su transparencia, y la disponibilidad de potentes técnicas genéticas, permitiendo el examen de las sinapsis nativas en animales intactos.

Aquí presentamos un método para cuantificar marcadas con fluorescencia receptores de los neurotransmisores sinápticos en C. elegans. Su característica clave es la identificación automática y análisis de las sinapsis individuales en tres dimensiones en varios archivos planos microscopio confocal de salida, la posición de la tabulación, el volumen, la intensidad de fluorescencia, y la fluorescencia total de cada sinapsis. Este enfoque tiene dos ventajas principales sobre el análisis manual de las proyecciones de Z-Plane de datos confocal. En primer lugar, porque todos los planos del conjunto de datos confocal se incluye, no hay datos se pierden a través de proyección plano z, por lo general basada en las medias de intensidad de pixel o máximos. Identificación En segundo lugar, de las sinapsis es automático, pero puede ser inspeccionado por el exexperimentador medida que avanza el análisis de datos, lo que permite la extracción rápida y precisa de los datos de un gran número de sinapsis. Cientos de miles de sinapsis por la muestra se puede obtener fácilmente, produciendo grandes conjuntos de datos para maximizar la potencia estadística. Consideraciones para la preparación de C. elegans para el análisis, y la realización de la imagen confocal para minimizar la variabilidad entre los animales dentro de los grupos de tratamiento también se discuten. Aunque se desarrolló para analizar C. receptores postsinápticos elegans, este método es útil en general para cualquier tipo de sinápticamente-localizada proteína, o de hecho, cualquier señal de fluorescencia que se localiza en racimos discretos, puncta o orgánulos.

El procedimiento se realiza en tres etapas: 1) preparación de muestras, 2) imagen confocal, y 3) el análisis de imágenes. Pasos 1 y 2 son específicos a C. elegans, mientras que el paso 3 es generalmente aplicable a cualquier señal de fluorescencia punteada en micrografías confocal.

Protocol

1. Preparación de los gusanos de la Imagen Este segmento del protocolo está basado en los C. técnicas de cultivo elegans 1,2, y se describe en la Figura 1. Criar gusanos de alta las placas de agar peptona NGM (10 cm) sembradas con E. NA22 la bacteria E. hasta casi morir de hambre. Si inmunotinción, una placa, producirá gusanos suficientes para una persona mancha, teniendo en cuenta las pérdidas a lo largo del ca…

Discussion

El método que aquí se presenta está diseñado para extraer parámetros cuantitativos de múltiples datos para grandes poblaciones de las sinapsis en C. elegans, al tiempo que maximiza la consistencia dentro de los grupos de tratamiento. Tres características de contribuir a estos objetivos. En primer lugar, inmunotinción se realiza en las poblaciones de gusano síncronos para asegurar que todos los animales tienen la misma edad. Este paso es crítico porque la regulación del desarrollo de los niveles de ex…

Materials

Name of the software	Company		Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher	PerkinElmer/Improvision		Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
			Table 2. Specific reagents and equipment.
			Egg buffer NaCl KCl CaCl2 MgCl2 HEPES (Adjust pH to 7.3) 118 mM 48 mM 2 mM 2 mM 24 mM Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening) 10 N NaOH ddH2O 1.0 ml 0.25 ml 3.75 ml
			Table 1. Solutions.