Automatiserad Kvantifiering av synaptisk Fluorescens i<em> C. elegans</em
Summary
Förekomsten av neurotransmittorreceptorer klustrade vid synapser påverkar starkt synaptisk styrka. Denna metod kvantifierar fluorescensmärkta neurotransmittorreceptorer i tre dimensioner med enkel-synaps upplösning i<em> C. elegans</em>, Vilket gör att hundratals synapser att snabbt präglas i ett enda prov utan störningar införs genom z-planet projektion.
Abstract
Synapse styrka hänvisar till amplituden postsynaptiska svar presynaptiska evenemang neurotransmitterfrisättning, och har en stor inverkan på den totala neural krets funktion. Synapse styrka beror till stor del på det överflöd av neurotransmittorreceptorer klustrade på synaptiska ställen på postsynaptiska membranet. Receptor nivåer är etablerade utvecklingsmässigt och kan ändras genom receptor trafficking mellan yt-lokaliserad, subsynaptic och intracellulär pooler, som representerar viktiga mekanismer för synaptisk plasticitet och neuromodulering. Rigorösa metoder för att kvantifiera synaptiskt-lokal överflöd signalsubstansen receptor är viktigt att studera synaptisk utveckling och plasticitet. Fluorescensmikroskopi är en optimal lösning, då den bevarar rumslig information, och skilja synaptisk från icke-synaptiska pooler och diskriminering bland receptorpopulationer lokaliserade till olika typer av synapser. Den genetiska modellorganism Caenorhabditis elegans är särskilt väl lämpad för dessa studier på grund av den ringa storleken och den relativa enkelheten i dess nervsystemet, dess transparens, och tillgängligheten av kraftfulla genetiska tekniker, medger undersökning av nativa synapser i intakta djur.
Här presenterar vi en metod för att kvantifiera fluorescensmärkta synaptiska neurotransmittor-receptorer i C. elegans. Dess viktigaste funktion är automatiserad identifiering och analys av enskilda synapser i tre dimensioner i flera plan konfokala filer mikroskop produktionen, tabulering ställning, volym, fluorescens intensitet och total fluorescens för varje synaps. Detta tillvägagångssätt har två huvudsakliga fördelar jämfört manuell analys av z-plana projektioner av konfokala data. Först, eftersom varje plan konfokala datamängden ingår, inga data som förloras genom z-planet projektion, vanligtvis baserat på pixelintensiteten genomsnitt eller maxima. Andra, identifiering av synapser är automatiserad, men kan inspekteras av frittperimenter som dataanalysen fortskrider, vilket tillåter snabb och exakt extraktion av data från ett stort antal synapser. Hundratals till tusentals synapser per prov kan lätt erhållas, som producerar stora datamängder för att maximera statistisk styrka. Överväganden för beredning C. elegans för analys, och utför konfokal avbildning för att minimera variabiliteten mellan djur inom behandlingsgrupperna diskuteras också. Även utvecklades för att analysera C. elegans postsynaptiska receptorer, är denna metod i allmänhet är användbara för alla typer av synaptiskt-lokaliserad protein, eller faktiskt varje fluorescenssignalen som är lokaliserat till diskreta kluster, puncta eller organeller.
Ingreppet görs i tre steg: 1) beredning av prover, 2) konfokal avbildning, och 3) bildanalys. Steg 1 och 2 är specifika för C. elegans, medan steg 3 är i allmänhet tillämpliga på alla punktformig fluorescenssignal i konfokala mikrografer.
Protocol
Discussion
Metoden som presenteras här är utformad för att extrahera kvantitativa multi-parameterdata för stora populationer av synapser i C. elegans, samtidigt maximera enhetlighet inom behandlingsgrupper. Tre funktioner bidra till dessa mål. Först immunfärgning utförs på synkrona mask populationer för att se till att alla djur är i samma ålder. Detta steg är avgörande eftersom utvecklande reglering av uttryck nivåer kan dölja effekterna av experimentell behandling (t.ex. UNC-49 GABA-receptorn immunofluor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka A. Benham för att hjälpa med utvecklingen av protokollet. Detta arbete har finansierats av NIH anslag NS06747 till Bab
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. |
Referências
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
