Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Resumo

A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização complexo In vitro.

Resumo

A fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR), um canal de cloreto localizados principalmente nas membranas apicais das células epiteliais, desempenha um papel crucial na homeostasia de fluidos transepitelial ^1-3. CFTR tem sido implicado em duas doenças principais: fibrose cística ⁴ (CF) e secretora diarreia ^5. Na FC, a síntese ou a actividade funcional do CFTR Cl-canal é reduzida. Esta doença afecta cerca de 1 em 2500 caucasianos nos Estados Unidos ^6. Actividade CFTR excessiva também tem sido implicado em casos de toxina induzida por diarreia secretória (por exemplo, por toxina da cólera e enterotoxina calor coli estável E.) que estimula a produção de cAMP ou cGMP no intestino ^7.

Evidências sugerem a existência de interações físicas e funcionais entre CFTR e um número crescente de outras proteínas, incluindo os transportadores, canais iônicos, receptores, quinases, fosfatases, sinalmoléculas ing, e os elementos do citoesqueleto, e estas interacções entre CFTR e as suas proteínas de ligação têm sido mostrados para ser criticamente envolvidos na regulação mediada por CFTR transporte de iões transepitelial in vitro e também in vivo ^8-19. Neste protocolo, vamos nos concentrar apenas sobre os métodos que auxiliam no estudo das interações entre CFTR cauda carboxilo terminal, que possui um motivo de ligação às proteínas [referido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e um grupo de andaime proteínas, que contêm um módulo de ligação específica referida como domínios PDZ. Até agora, várias proteínas diferentes PDZ andaime têm sido relatados para se ligar ao terminal carboxilo da cauda de CFTR, com afinidades diferentes, tais como NHERF1 e NHERF2 e PDZK1 e PDZK2, CAL (CFTR-associated ligando), Shank2, e agarrar ^20-27. O motivo PDZ dentro CFTR que é reconhecido pelo PDZ andaime proteínas são os últimos quatro aminoácidos no terminal C (ie, 1477-DTRL-1480 em CFTR humano) ^20. Curiosamente,CFTR pode ligar mais do que um domínio PDZ de ambos os NHERFs e PDZK1, embora com diferentes afinidades ^22. Este multivalência com respeito à ligação CFTR foi mostrado para ser de importância funcional, sugerindo que as proteínas PDZ andaime pode facilitar a formação de complexos macromoleculares CFTR sinalização para a sinalização específicas / selectiva e eficaz em células ^16-18.

Vários ensaios bioquímicos têm sido desenvolvidos para estudar CFTR-envolvendo interacções proteína, tais como co-imunoprecipitação, suspenso ensaio, pares ensaio de ligação, por pares de ensaio colorimétrico de ligação, e doseamento macromolecular montagem complexa ^16-19,28,29 . Aqui vamos nos concentrar sobre os procedimentos detalhados de montagem de um PDZ motivo dependente da CFTR macromolecular contendo complexo in vitro, que é usado amplamente por nosso laboratório para estudar proteína-proteína ou domínio domínio interações envolvendo CFTR ^16-19,28,29.

Protocolo

1. Expressão e Purificação de Proteínas de Fusão recombinantes Tagged em bactérias

1. Amplificar regiões definidas do C-caudas (os últimos 50-100 aminoácidos contendo os motivos PDZ em C-terminal) para CFTR, LPA _2, MRP2, MRP4, β ₂ AR, e NHERFs (comprimento completo ou PDZ1 ou PDZ2 domínios ) por metodologia de PCR.
2. Clonar os produtos de PCR em pGEX4T-1 vector para GST-proteínas de fusão (tal como GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vector para MBP de fusão de proteínas (tais como MBP-β ₂ AR CT, MBP-CFTR CT ), e pET30 para His-S-proteínas de fusão (como o seu-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).
3. Transformar num E.

Discussão

Neste protocolo que demonstraram um método para a montagem in vitro e detecção de um complexo macromolecular CFTR contendo sinalização utilizando proteínas purificadas (ou fragmentos de proteínas) e / ou lisados ​​celulares como relatado anteriormente ^16-19,29,30. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem especial atenção:

• É importante que o pH do tampão de eluição ser ajustado para 8,0 após a adição de glutationa reduzida qu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
pGEX4T-1 vector	GE Healthcare	28-9545-49	anteriormente Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector	New England Biolabs
pET30 vector	Merck Química	69077-3	anteriormente Novagen
Esferas de agarose de glutationa	BD Biosciences	554780
Resina de amilose	New England Biolabs	E8021S
Contas Talon	Clontech	635501
glutationa reduzida	BD Biosciences	554782
imidazol	Pescador	BP305-50
maltose	Pescador	BP684-500
S-proteína de agarose	Merck Química	69704-3	anteriormente Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-IgG CFTR	Feito sob encomenda	R1104	mAb reconhecendo CFTR epítopo em aa 722-734
Anti-IgG MRP2	Chemicon International	MAB4148	Agora uma parte da Millipore

Tabela 2. Reagentes específicos e equipamentos.