In Vitro Analyse av PDZ-avhengige CFTR makromolekylær signalveier Komplekser

Summary

Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR), en epitelial klorid kanal, har blitt rapportert å samhandle med ulike proteiner og regulere viktige cellulære prosesser; blant dem CFTR PDZ motiv-medierte interaksjoner er godt dokumentert. Denne protokollen beskriver metoder vi utviklet for å montere en PDZ-avhengig CFTR macromolecular signaliserte kompleks<em> In vitro</em>.

Abstract

Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR), en klorid kanal ligger hovedsakelig i den apikale membraner i epitelceller, spiller en avgjørende rolle i transepithelial væske homeostase ^1-3. CFTR har vært innblandet i to alvorlige sykdommer: cystisk fibrose (CF) ⁴ og sekretoriske diaré ^fem. I CF, er syntesen eller funksjonell aktivitet av CFTR Cl-kanalen redusert. Denne lidelsen påvirker ca 1 i 2500 kaukasiere i USA ^seks. Overdreven CFTR aktivitet har også vært innblandet i tilfeller av toksin-indusert sekretorisk diaré (for eksempel ved koleratoksin og varme stabil E. coli enterotoksin) som stimulerer cAMP eller cGMP produksjon i tarmen ^7.

Innsamling av bevismateriale tyder eksistensen av fysiske og funksjonelle samspillet mellom CFTR og et økende antall andre proteiner, inkludert transport, ionekanaler, reseptorer, kinaser, fosfataser, signaling molekyler, og cytoskeletal elementer, og disse interaksjoner mellom CFTR og dets proteiner har vist seg å være kritisk involvert i regulering av CFTR-mediert transepithelial ion transport in vitro og in vivo også ^8-19. I denne protokollen, fokuserer vi kun på de metoder som hjelpemiddel i studiet av samspillet mellom CFTR carboxyl terminal hale, som besitter en protein-bindende motiv [referert til som PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motiv], og en gruppe av stillas proteiner, som inneholder en spesifikk binding modul kalt PDZ domener. Så langt har flere forskjellige PDZ stillaset proteiner er rapportert å binde til carboxyl terminal hale av CFTR med ulike slektskap, som NHERF1 og NHERF2 og PDZK1 og PDZK2, Cal (CFTR-assosiert ligand), Shank2, og ta tak ^20-27. Den PDZ motiv innenfor CFTR som er anerkjent av PDZ stillaset proteiner er de siste fire aminosyrene på C endestasjonen (dvs. 1477-DTRL-1480 i human CFTR) ^20. Interessant,CFTR kan binde mer enn ett PDZ domene av både NHERFs og PDZK1, dog med varierende slektskap ^22. Dette multivalency med hensyn til CFTR bindende har vist seg å være av funksjonell betydning, noe som tyder på at PDZ stillaset proteiner kan fremme dannelsen av CFTR macromolecular signalisere komplekser for spesifikke / selektiv og effektiv signalering i cellene ^16-18.

Flere biokjemiske analyser har blitt utviklet for å studere CFTR-involverer protein interaksjoner, for eksempel co-immunoprecipitation, pull-down analysen, par-klok bindende analysen, kolorimetrisk par-klok bindende analysen, og macromolecular kompleks montering analysen ^16-19,28,29 . Her fokuserer vi på de detaljerte prosedyrene og sammenstille et PDZ motiv-avhengig CFTR-holdig macromolecular kompleks in vitro, som brukes mye av vårt laboratorium for å studere protein-protein eller domene-domene interaksjoner som involverer CFTR ^16-19,28,29.

Protocol

1. Uttrykk og rensing av rekombinant tagget Fusion Proteiner i Bakterier Forsterke definerte regioner i C-haler (de siste 50-100 aminosyrene som inneholder PDZ motivene ved C-terminus) for CFTR, 2 år 2. LPA, MRP2, MRP4, β, og NHERFs (full-lengde eller PDZ1 eller PDZ2 domener ) ved PCR tilnærming. Klone PCR produktene til pGEX4T-en vektor for GST-fusion proteiner (for eksempel GST-NHERFs, GST-MRP4 CT), pMAL-C2 vektor for MBP-fusion proteiner (som MBP-β 2 AR CT, MB…

Discussion

I denne protokollen viste vi en metode for in vitro montering og påvisning av en CFTR inneholder macromolecular signalisere kompleks med rensede proteiner (eller protein fragmenter) og / eller celle lysates som rapportert tidligere ^16-19,29,30. For å oppnå best mulig resultat følgende kritiske punkter under forberedelsen prosessen krever spesiell oppmerksomhet:

• Det er viktig at pH i eluering buffer bli justert til 8,0 etter at redusert glutation når rense GST-fusion protein som besk…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
pGEX4T-1 vector	GE Healthcare	28-9545-49	formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector	New England BioLabs
pET30 vector	EMD Chemicals	69077-3	formerly Novagen
Glutathione agarose beads	BD Biosciences	554780
Amylose resin	New England BioLabs	E8021S
Talon beads	Clontech	635501
reduced glutathione	BD Biosciences	554782
imidazole	Fisher	BP305-50
maltose	Fisher	BP684-500
S-protein agarose	EMD Chemicals	69704-3	formerly Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-CFTR IgG	Custom-made	R1104	mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG	Chemicon International	MAB4148	Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.