控制扩展成体干细胞是一个重要的因素,阻碍了他们的研究,并在治疗中使用。在这里,我们描述了一种系统,在时间控制在开发过程中膨胀和成年期神经干细胞,可用于增加在小鼠大脑产生的神经元的数目。
成体干细胞可以分化以产生额外的干细胞(膨胀)或多个不同类型的细胞(分化),这是根本胚胎发育过程中的组织的形成和组织的平衡,在成年期1。目前,下大力气投资对控制扩展到分化的成体干细胞的开关,因为这被认为是发展新的战略再生医学1,2的基础。然而,成体干细胞的研究和利用的一大挑战是,他们的扩张已被证明是非常难以控制的。
在这里,我们描述了一个系统,允许通过操纵CDK4/cyclinD1的复杂的表达,G1期的主要调节控制神经干/祖细胞在小鼠胚胎皮质或成年海马(共简称为NSC)扩展的细胞周期和体干细胞差异erentiation 3,4。具体地说,两种不同的方法,其中所述的cdk4/cyclinD1复杂的是过度的NSC 体内 。通过第一种方法,是通过以下方式获得注入质粒编码CDK4/cyclinD1的在管腔中的鼠标端脑在子宫内的电穿孔后跟交付给NSC的横向皮质,从而,引发的游离表达过度的细胞周期调节转基因5-8。由所述第二方法中,高度浓缩的艾滋病毒衍生的病毒立体定位注射在成年小鼠海马齿状回,因此,触发整合后的病毒构建体在感染的细胞的基因组中9的组成型表达的细胞周期调节。这两种方法,其基本原则已经其他视频协议10-14优化为i)减少组织损伤,二宽的部分)的目标非常特定的大脑区域选择性ns中,ⅲ)获得高操纵细胞数目在每个区域内,和iv)触发在每个小区之内的外源基因的高表达水平。瞬时过量表达的转基因使用这两种方法是通过不同的方式,即通过自然稀释的电穿孔质粒由于细胞分裂或他莫昔芬的管理Cre重组酶表达NSC感染病毒携带CDK4/cyclinD1的两侧loxP位点,分别为9,15 。
这些方法提供了一个非常强大的平台,急性和任何基因的表达,在小鼠大脑组织专门的操作。通过操纵的CDK4/cyclinD1的复杂的表达,特别是,我们的系统允许的时间控制的NSC扩展及其分化中的开关,从而,最终提高哺乳动物大脑中产生的神经元的数目。我们的方法是非常重要的基础研究和使用成体干细胞治疗干细胞组织的形成作出贡献的哺乳动物的中枢神经系统,同时提供更好地了解我)在开发过程中,二)组织的平衡在成年期,三)成人神经认知功能的作用,也许四)更好地利用成体干神经退行性疾病的模型中的细胞。
在子宫穿孔的一个关键步骤是因为它的定向迁移在分娩过程中的电场取决于它的电荷的DNA的质量和纯度。 DNA纯化的协议“,不包括额外电荷的分子,如内毒素的除去,可能会导致掩蔽的天然DNA的负电荷导致出货不畅。显然,尽可能接近以有针对性的面积与电极接触子宫壁将提高电穿孔效率。同样重要的是使用,因为这是基本为提供最佳的电场的电极的质量。微划痕甚至没有可见的眼和/或有机残基,如血清痕迹,脂类,等等,将不可避免地随时间而累积,导致失去它们的属性的电极。 ,老和/或脏electropes的最可能的原因突然下降,电效率,因此,应该是replaced,因为这是发现。虽然比较简单, 子宫穿孔 ,通常需要几个星期的训练,以达到满意的和可重复性的结果。这种技术是非常通用的,因为它可以被应用,实际上,任何器官和组织的胚胎发育。当然,含有的空腔,如脑,器官是特别容易的目标,并允许由于易于注射相对大体积的DNA的转染细胞的比例很高。
设立立体定向病毒注射过程中遇到的一个常见的问题是很少有感染的细胞和/或不期望的区域为目标。第一个问题主要是与注射低滴度的病毒。 293T细胞数量较少的通道,文化的增长速度和较高的病毒滴度。使用细胞的年纪比约。 20代不是推荐的装置,与小于80%的效率的转染将不能保证是好的病毒的产生。再悬浮的病毒颗粒也很关键,病毒悬浮液出现同质和病毒的团块可能阻塞毛细管有要避免。病毒是非常敏感的温度下降和长期贮存。出于这个原因,等分试样需要被永久保存在-80℃下,并不能再冷冻。即使在这些条件下,可观察到减少传染性6-12个月后的存储。在学习阶段,我们建议,以测试每个病毒制备的病毒滴度,并做了一遍后长期储存。感染的细胞中存在的不想要的大脑区域可以依赖于一个次优的定位鼠标的头部立体定位框架,这需要一些练习。此外,它是开放颅骨上的孔的同时,不要损坏大脑表面的关键,因为否则它不会有可能正确地复位0上的软膜的表面上,导致不精确的注射。坐标我们在本协议中被称为C57/BL6 6-10周岁女性,我们建议优化他们针对不同的应变/年龄/性别。这项技术的收购,可能需要更多的时间比在子宫穿孔阶段的时间越长,需要准备的病毒和分析样本。我们强烈建议,病毒只用鼠标手术,立体定向注射后,已成为可靠和可重复性。实现这一目标的第一个步骤是注入细胞穿透物DNA Hoechst 33342荧光染料,例如,在实施安乐死的小鼠,并立即分析大脑。
要敏锐地是两个强大的系统和组织,特别是中枢神经系统内的控制基因的表达在哺乳动物发育和成年期的子宫穿孔和立体的病毒注射。尽管他们的目标只有一个细胞亚群的限制,这些系统提供了前所未有的速度和易用性相比更传统的方法,我Ň尤其是费时费力代的转基因小鼠。然而,尽管这种相似性,存在着一些不同的两种技术之间的,是值得一提。首先,针对不同类型的细胞, 在子宫内的电穿孔方面最初导致转染适当的干细胞(也称为放射状胶质细胞),因为这些是唯一的细胞限定的DNA被注入脑室。作为细胞分裂的结果,质粒将随后被从针对性,母亲干细胞继承其祖细胞和/或神经元的子细胞,作为时间的函数的整个皮质导致转染细胞的再分配。与此相反,在成人大脑使用艾滋病毒慢病毒导致的任何细胞类型,包括间充质干细胞,前体细胞,神经元,以及成熟的神经胶质细胞的同时感染。值得注意的是,关于使用艾滋病毒慢病毒,而不是更常用的逆转录病毒是事实慢病毒的整合将独立地发生从有丝分裂的细胞的状态,从而使成人,静态干细胞的定向也。
其次,电穿孔和病毒感染之间的另一个重要的区别是,一个暂时的,游离表达来实现,而不是由前者在后者所取得的受感染的细胞的基因组中的DNA的不可逆结合。作为一个结果,连续的细胞分裂,将电穿孔的质粒稀释,和异位cyclinD1蛋白的降解,就会随之于各细胞周期。因此,扩大胚胎发育过程中的NSC大约两天15只,而在成人大脑中发现这种效果持续数月(结果未显示)。
第三,因为我)cdk4/cyclinD1具有较强的影响对细胞具有较长的G1及ii)致力于神经祖细胞发育过程中有较长的细胞周期于干细胞,而在成年期则相反,我们的操作触发的扩张,主要是在开发和干细胞在成年神经祖细胞。在任一情况下,在神经元的增加这两种方法已取得了。
第四,病毒注射可以很容易地进行,可靠和可重复的,在许多不同的区域的成年脑立体定位坐标通过简单地改变。与此相反,精确定位的中枢神经系统的某些区域,如脑干,海马阵型,或者脊髓, 在子宫穿孔可能会对更难以实现再现性。此外,可以执行对任何年龄的小鼠而立体定位注射, 子宫穿孔的最佳性能是有限的约E11至E16。至E11之前阶段,将需要使用的超声波后向散射显微镜18,19或全胚胎邪教余吕杏茜系统17,20。
近日,成体干细胞的基础细胞生物学的兴趣越来越被推广,因为他们的学习和操作被认为是对开发新的基于细胞的再生疗法的基础。特别是过度的CDK4/cyclinD1的,我们的协议提供的装置,一过性增加扩展的NSC 在体内 ( 图3B和C和图4B和C),以增加在成人大脑产生的神经元的数目。我们认为,这些操作可能是很重要的作用NSC在不同的上下文,以便更好地了解大脑发育,演化和平衡,以及他们的认知功能或神经系统的退化或损伤的恢复。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了中心的再生疗法,医学系的德累斯顿,与东风集团的合作研究中心SFB655(子项目A20)。 BA支持DIGS-BB计划,德累斯顿的奖学金。我们感谢博士。纪子大隅,野村忠,迪特尔Chichung列,和拉维Jagasia的宝贵意见期间设立在子宫穿孔和立体的病毒注射。
Material/equipment | Supplier | Catalog # | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Endofree maxi plasmid kit | Qiagen | 12362 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
FastGreen | Sigma | F7258 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
P-97 Flaming/Brown pipette puller | Sutter Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate capillaries with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Table top laboratory animal anesthesia system | VetEquip | 901806 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Isofluran | Baxter | HDG9623 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Germinator 500 glass bead sterilizer | SouthPointe Surgical | GRM5-1460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Iris forceps | WPI | 15917 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Betaisodona solution | Mundipharma | 1931491 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Pico Pump | WPI | PV820 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Round tweezer electrodes | NEPAGENE | CUY650P1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Suture material | Ethicon | V493H | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Reflex clip applier for wound closure | WPI | 500345 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Temgesic injection solution | Essex Pharma AG | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM w/Glutamax-I | Invitrogen | 31966021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Fetal Bovin Serum | Invitrogen | 1027016 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomicin | Gibco | 15140 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture dish | Falcon | 353003 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Polyethylenimine 250 ml | Sigma-Aldrich | 40872-7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
n-Butyric acid, sodium salt | Sigma | B 5887 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Tube, thinwall, polyallomer | Beckman | 326823 / 331374 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Model 900 small animal stereotaxic instrument | Kopf Instruments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
OPMI pico microscope | Zeiss | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector | WPI | B203MC4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
Glass replacement 3.5 nanoliter | WPI | 4878 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
SR drill general application | Foredam | K2272 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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