זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation
Summary
Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.
Abstract
Microglia הם תאים של שושלת מיאלואידית הנמצאים במערכת העצבים המרכזית (CNS) 1. תאים אלה ממלאים תפקיד חשוב פתולוגיות של מחלות רבות הקשורות neuroinflammation כמו טרשת נפוצה (MS) 2. Microglia בעוד כמה CNS רגילים להביע CD11b מקרופאג סמן ולהציג פנוטיפ מנוחה בהבעת רמות נמוכות של סמנים הפעלה כגון CD45. במהלך אירועים פתולוגיים מערכת העצבים המרכזית, microglia להיות מופעל כפי שנקבע על ידי upregulation של CD45 ו סמנים אחרים 3. הגורמים המשפיעים על הפנוטיפ microglia פונקציות מערכת העצבים המרכזית לא למד היטב. מיקרו RNA (miRNAs) משפחה הולך וגדל של מולקולות המשתמרים (~~~HEAD=NNS 22 נוקלאוטידים ארוך) כי הם מעורבים בתהליכים פיזיולוגיים רבים רגילים כגון צמיחת תאים והתמיינות 4 ו מחלות כגון דלקת 5. MiRNAs downregulate את הביטוי של גנים מסוימים היעד של רצפים משלימים מחייב שלIR mRNAs ולשחק תפקיד חשוב ההפעלה של תאים חיסוניים מולדים כולל מקרופאגים 6 ו מיקרוגליה 7. על מנת לחקור מירנה בתיווך מסלולים המגדירים את הפנוטיפ microglial, פונקציה ביולוגית, להבדיל microglia מסוגים אחרים של מקרופאגים, חשוב להעריך כמותית את הביטוי של מיקרו RNA מסוימות תת שונים של מערכת העצבים המרכזית microglia תושב. השיטות המקובלות למדידת ביטוי miRNAs מערכת העצבים המרכזית כולל PCR כמותי מן הרקמה העצבית כולה ב ההכלאה באתרה. עם זאת, PCR כמותי מן homogenate הרקמה כולה אינה מאפשרת הערכת הביטוי של מירנה ב microglia, אשר מייצגים רק 5-15% מכלל התאים של הרקמה העצבית. ההכלאה באתרם מאפשרת הערכת הביטוי של microRNA של סוגי תאים מסוימים בסעיפים רקמות, אך שיטה זו אינה כמותית לחלוטין. בדו"ח זה אנו מתארים כמותית sensשיטת itive לצורך זיהוי של מירנה על ידי בזמן אמת PCR ב microglia מבודד CNS רגילים או במהלך neuroinflammation באמצעות Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE), מודל העכבר על טרשת נפוצה. בשיטה המתוארת יהיה שימושי כדי למדוד את רמת הביטוי של מיקרו RNA ב microglia ב CNS רגילים או במהלך neuroinflammation קשור פתולוגיות שונות, כולל טרשת נפוצה, פגיעה שבץ, טראומה, מחלת אלצהיימר גידולים במוח.
Protocol
Discussion
לאחרונה עניין רב ניתנה microglia ומעורבות של תאים אלה מחלות רבות הקשורות neuroinflammation ו ניוון מוחיים. בנוסף, התפקיד של מיקרו RNA של התמיינות של תאים חיסוניים וסרטן גדל באופן דרמטי על 5,10 מספר השנים האחרונות. דיווחנו בעבר את התפקיד של miR-124 בשמירה על הפנוטיפ לא פעיל או מנוחה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי R01 NIH NS071039-01A1 מענק מחקר.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referências
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
