الكشف عن MicroRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الجهاز العصبي المركزي للمعلمين وأثناء Neuroinflammation
Summary
الخلايا الدبقية الصغيرة يقيمون الضامة التي تقدم في السطر الأول من مراقبة الدفاع والمناعة في الجهاز العصبي المركزي. MicroRNAs هي جزيئات التنظيمية التي تلعب دورا هاما في العمليات الفسيولوجية بما في ذلك العديد من التنشيط وتمايز الضامة. في هذه المقالة، نحن تصف طريقة لقياس microRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا من سلالة الدم النخاعي الموجودة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) 1. هذه الخلايا تلعب دورا هاما في أمراض العديد من الأمراض المرتبطة neuroinflammation مثل التصلب المتعدد (MS) 2. الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي العادية التعبير عن بلعم علامة CD11b ويحمل النمط الظاهري يستريح بالإعراب عن مستويات منخفضة من علامات تفعيل مثل CD45. خلال أحداث مرضية في الجهاز العصبي المركزي، تصبح الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها على النحو الذي يحدده upregulation من CD45 وعلامات أخرى 3. ليست هي العوامل التي تؤثر على الخلايا الدبقية الصغيرة النمط الظاهري وظائف في الجهاز العصبي المركزي مدروسة. MicroRNAs (miRNAs) هي عائلة متزايد من الجزيئات المحمية (~ 22 النيوكليوتيدات طويلة) التي تشارك في العديد من العمليات الفيزيولوجية الطبيعية مثل نمو الخلايا والتمايز (4) والأمراض مثل التهاب 5. MiRNAs downregulate التعبير عن جينات معينة مستهدفة من قبل متواليات مكمل ملزم للالأشعة تحت الحمراء mRNAs وتلعب دورا مهما في تنشيط خلايا المناعة الفطرية بما في ذلك الضامة (6) والخلايا الدبقية الصغيرة 7. من أجل التحقيق ميرنا بوساطة المسارات التي تحدد النمط الظاهري دبقية صغيرة، وظيفة بيولوجية، وعلى التمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة من أنواع أخرى من الضامة، فإنه من المهم إجراء تقييم كمي للتعبير عن microRNAs خاصة في مجموعات فرعية مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة. الطرق الشائعة لقياس التعبير عن miRNAs في الجهاز العصبي المركزي وتشمل PCR الكمي من الأنسجة العصبية كله وتهجين موضعية. ومع ذلك، PCR الكمي من جناسة الأنسجة كله لا يسمح بتقييم التعبير عن ميرنا في الخلايا الدبقية الصغيرة، التي لا تمثل سوى 5-15٪ من خلايا الأنسجة العصبية. التهجين في الموقع يسمح بتقييم التعبير microRNA في أنواع معينة من الخلايا في المقاطع الأنسجة، ولكن هذه الطريقة ليست كمية تماما. نحن في هذا التقرير وصفا لكمية وSENSمكنته طريقة للكشف عن ميرنا من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من الجهاز العصبي المركزي أو العادي خلال neuroinflammation باستخدام التهاب الدماغ والنخاع الذاتية التجريبية (EAE)، نموذج الفأر لمرض التصلب العصبي المتعدد. والطريقة الموصوفة أن تكون مفيدة لقياس مستوى من التعبير عن microRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي أو العادي خلال neuroinflammation المرتبطة بأمراض مختلفة بما في ذلك مرض التصلب العصبي المتعدد والسكتة الدماغية وإصابات الصدمة، ومرض الزهايمر وأورام المخ.
Protocol
Discussion
مؤخرا اعطيت اهتماما كبيرا لدى الخلايا الدبقية الصغيرة وإشراك هذه الخلايا في العديد من الأمراض المرتبطة neuroinflammation وتنكس عصبي. وبالإضافة إلى ذلك، نما دور microRNAs في تمايز الخلايا المناعية والسرطان بشكل كبير خلال السنوات القليلة الماضية 5،10. وذكرت ونحن في السابق دو…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS071039 R01-01A1 منحة بحثية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Referências
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
