Mikroglia er bosiddende makrofager, der giver den første linje i forsvaret og immun-overvågning af det centrale nervesystem. MicroRNA er regulatoriske molekyler, som spiller en vigtig rolle i mange fysiologiske processer, herunder aktivering og differentiering af makrofager. I denne artikel beskriver vi metoden til måling af microRNA i mikroglia.
Mikroglia er celler af myeloid herkomst, som ligger i det centrale nervesystem (CNS) 1. Disse celler spiller en vigtig rolle i sygdomme i mange sygdomme forbundet med neuroinflammation såsom dissemineret sklerose (MS) 2. Mikroglia i en normal CNS udtrykke makrofag markør CD11b og udviser en hvilende fænotype ved at udtrykke lave niveauer af aktivering markører såsom CD45. Under patologiske begivenheder i centralnervesystemet, er blevet microglia aktiveres som bestemt ved opregulering af CD45 og andre markører 3. De faktorer, der påvirker microglia fænotype og funktion i CNS er ikke godt undersøgt. MicroRNA (miRNA) er en voksende familie af konserverede molekyler (ca. 22 nukleotider lange), der er involveret i mange normale fysiologiske processer, såsom cellevækst og-differentiering 4 og patologier, såsom inflammation 5. MiRNA nedregulere ekspressionen af visse målgener ved at binde komplementære sekvenserir mRNA'er og spiller en vigtig rolle i aktiveringen af medfødte immunceller, herunder makrofager 6 og mikroglia 7. For at undersøge miRNA-medierede veje, som definerer mikroglial fænotype, biologisk funktion, og til at skelne microglia fra andre typer af makrofager, er det vigtigt at kvantitativt at vurdere ekspressionen af bestemte microRNA'er i særskilte undergrupper af CNS-resident microglia. Almindelige metoder til måling af ekspression af miRNA i CNS omfatter kvantitativ PCR fra hele neuronvæv og de situ hybridisering. Imidlertid ikke kvantitativ PCR fra hele vævshomogenat ikke tillade vurdering af ekspressionen af miRNA i microglia, som kun udgør 5-15% af cellerne i neuronalt væv. Hybridisering in situ tillader vurdering af ekspressionen af microRNA i specifikke celletyper i vævssnit, men denne metode er ikke helt kvantitativ. I denne rapport beskriver vi en kvantitativ og sensitive fremgangsmåde til påvisning af miRNA ved real-time PCR microglia isoleret fra normale CNS eller under neuroinflammation hjælp eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), en muse-model for MS. Den beskrevne fremgangsmåde vil være nyttig til at måle niveauet af ekspression af microRNA'er i mikroglia i normale CNS eller under neuroinflammation forbundet med forskellige patologier, herunder MS, slagtilfælde, traumatisk skade, Alzheimers sygdom og hjernetumorer.
Nylig væsentlig interesse blev givet til microglia og involvering af disse celler i mange patologier forbundet med neuroinflammation og neurodegeneration. Desuden har rolle microRNA'er i differentieringen af immun-og cancerceller dramatisk dyrket i løbet af de sidste mange år 5,10. Vi har tidligere rapporteret rolle miR-124 i opretholdelse af ikke-aktiverede eller hvilende fænotype af mikroglia i normale CNS 7, men rollen af de andre typer microRNA'er i microglia fænotype og aktivering…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af NIH R01 NS071039-01A1 forskningsbevilling.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
CFA | DIFCO | 263810 | |
Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |