Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Summary

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Abstract

Microglia sono cellule della linea mieloide che risiedono nel sistema nervoso centrale (CNS) ^1. Queste cellule hanno un ruolo importante in patologie di molte malattie associate neuroinfiammatoria come la sclerosi multipla (MS) ^2. Microglia nel sistema nervoso centrale di un normale esprimere macrofagi CD11b marcatore e mostrano un fenotipo di riposo da esprimere bassi livelli di marker di attivazione quali CD45. Durante gli eventi patologici del sistema nervoso centrale, microglia si attivano come determinato dal upregulation di CD45 e di altri marcatori ^3. I fattori che influenzano il fenotipo e le funzioni di microglia nel sistema nervoso centrale non sono ben studiati. I microRNA (miRNA) sono una famiglia crescente di molecole conservate (circa 22 nucleotidi) che sono coinvolte in molti processi fisiologici come la crescita e la differenziazione cellulare ⁴ e patologie come l'infiammazione ^5. MicroRNA downregulate l'espressione di geni bersaglio determinati legame sequenze complementari dimRNA ir e svolgono un ruolo importante nella attivazione di cellule immunitarie innate tra macrofagi e microglia ^{6 7.} Al fine di indagare miRNA-mediate percorsi che definiscono la microglia fenotipo, funzione biologica, e per distinguere microglia da altri tipi di macrofagi, è importante per valutare quantitativamente l'espressione dei microRNA in particolari sottogruppi distinti del SNC residente microglia. Metodi comuni per misurare l'espressione dei miRNA nel SNC includono quantitativa PCR da intero tessuto neuronale e ibridazione in situ. Tuttavia, quantitativa PCR da omogenato tissutale intero non consente la valutazione dell'espressione di miRNA in microglia, che rappresentano solo 5-15% delle cellule del tessuto neuronale. Ibridazione in situ permette di valutare l'espressione di microRNA in specifici tipi cellulari nelle sezioni di tessuto, ma questo metodo non è del tutto quantitativa. In questo rapporto descriviamo una quantitativa e sensitive metodo per la rilevazione di miRNA dal real-time PCR in microglia isolato dal sistema nervoso centrale normali o durante neuroinfiammazione con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello murino di sclerosi multipla. Il metodo descritto sarà utile per misurare il livello di espressione dei microRNA in cellule microgliali in CNS normali o durante neuroinfiammazione associato a varie patologie tra cui sclerosi multipla, ictus, lesioni traumatiche, morbo di Alzheimer e tumori cerebrali.

Protocol

1. Isolamento della microglia dal CNS normali Isolamento di microglia viene eseguita come descritto in precedenza con modifiche 3. Preparare strumenti per la dissezione e la perfusione: forbici, pinze, siringa da 10 ml con ago 27g, 15 ml Dounce omogeneizzatore (Teflon / vetro), nylon 40 micron filtro cellulare, il 40% e 70% soluzioni di Percoll, 1X PBS. Euthanize topi per asfissia rapido (privazione di ossigeno) in CO 2 fotocamera e immediatamente t…

Discussion

Recentemente notevole interesse è stato dato a microglia e il coinvolgimento di queste cellule in molte patologie associate neuroinfiammazione e neurodegenerazione. Inoltre, il ruolo dei microRNA nella differenziazione delle cellule immunitarie e cancro è drammaticamente cresciuta negli ultimi anni diversi ^5,10. Abbiamo precedentemente riportato il ruolo di miR-124 nel mantenimento del fenotipo non attivata o di riposo della microglia nel CNS normali ^7, ma il ruolo degli altri tipi di microRNA ne…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1X PBS	GIBCO	14190	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS	Thermo Scientific	SH30258.02	Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS	GBCO	11965; 10438
miRVana kit	Invitrogen	AM1561
Percoll	Sigma	P4937-500 ml	100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma. 50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide	AnaSpec Inc	60130-5
CFA	DIFCO	263810
Pertussis Toxin	Sigma	P7208
FcR blocking antibodies	BD Biosciences	553142	Clone 2.4G2
Anti-CD11b–PE mAb	BD Biosciences	553311	Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs	Biolegend	103116	Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%)	EMS Inc	15710	Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel	Life Technologies Inc.	EC68855BOX
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit	Life Technologies Inc	4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix	Life Technologies Inc	4304437
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a	Life Technologies Inc	4427975 ID 001182
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55	Life Technologies Inc	4427975 ID 001228
Nuclease-free water	Life Technologies Inc	AM9937	Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate	Life Technologies Inc.	4309849	Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml)	Wheaton Science Products.	358044	Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer	Falcon	352340
Big centrifuge	Sorval	RT 6000B	Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge	Eppendorf	5415 R	Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument	Life Technologies Inc.	AB 7900 HT	Can be substituted with other instruments
Flow cytometer	BD Biosciencess	LSR II	Can be substituted with other instruments
FACS	BD Biosciences	FACSAria	Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 1000