Nós demonstramos um protocolo em que a administração do agente genotóxico azoximetano (AOM), seguido por três ciclos da pró-inflamatória de sódio sulfato de agente de dextrano (DSS) de forma rápida e consistentemente gera tumores do cólon em ratos com semelhanças morfológicas e moleculares para as observadas em humanos colite Associadas cancro.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Câncer de modelagem Colite Associada com Azoximetano (OMA) e sulfato de sódio Dextran (DSS)
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os indivíduos com a doença inflamatória do intestino (IBD), como a doença de Crohn (DC) ou a colite ulcerosa (UC) estão em risco aumentado de desenvolver cancro colo-rectal (CRC) nos indivíduos saudáveis. Este risco é proporcional à duração e à extensão da doença, com incidência cumulativa tão alta quanto 30% em indivíduos com UC de longa data com envolvimento do cólon generalizada. Uma displasia colônica em IBD e colite associada a câncer (CAC) Acredita-se que desenvolver como resultado de ciclos repetidos de lesão e reparação de células epiteliais, enquanto estas células são banhadas em meio de citocina inflamatória crónica. 2 Enquanto cancros espontâneos e colite associada a partilhar a qualidade de adenocarcinomas sendo, a sequência de eventos moleculares subjacentes acredita-se ser diferente. 3 Este distinção argumenta a necessidade de modelos animais específicos do CAC.
Modelos de ratos Existem actualmente vários para o estudo da CAC. Sulfato de dextrano sodihm (DSS), um agente com efeitos tóxicos directos sobre o epitélio do cólon, podem ser administrados na água de beber para ratos em vários ciclos para criar um estado inflamatório crónico. Com duração suficiente, alguns destes ratos desenvolvem tumores. 4 O desenvolvimento do tumor é acelerada, neste modelo, se administrado em um ambiente pró-carcinogénicos. Estes incluem os ratos com mutações genéticas em tumorigénese vias (APC, p53, Msh2), bem como ratinhos pré-tratados com agentes genotóxicos (azoximetano [OMA], 1,2-dimetil-hidrazina [DMH]) 5.
A combinação de DSS com OMA como um modelo para a colite câncer associado ganhou popularidade por sua reprodutibilidade, potência, preço baixo e facilidade de uso. Embora eles têm um mecanismo comum, AOM foi encontrada para ser mais potentes e estáveis em solução do que DMH. Embora o desenvolvimento de tumores em outros modelos requer geralmente de vários meses, camundongos injetados com AOM e subsequentemente tratados com DSS desenvolver tumores adequadas numas pouco como 7-10 semanas. 6, 7 Finalmente, AOM e DSS podem ser administrados a ratos de todo o fundo genético (knock out, transgénicos, etc), sem cruzamento de uma linhagem tumorigénico específico. Aqui, demonstramos um protocolo para a inflamação orientada tumorigénese do cólon em ratos, utilizando uma única injecção de AOM seguido por três ciclos de sete dias de DSS durante um período de 10 semanas. Este modelo induz tumores com alterações histológicas e moleculares muito semelhantes às que ocorrem em CAC humana e proporciona um modelo altamente valiosa para o estudo da quimioprevenção oncogénese e na doença. 8
Protocolo
1. Colite associada a indução de cancro
- Separe gaiolas de sexo e de mesma faixa etária 6-8 ratos semanas de idade para ser usado para grupos experimental e controle. Ratos podem ser individualmente rotulado com marcações da cauda ou clipes de ouvido.
- No dia 0, os pesos de base de registo e injectar por via intraperitoneal a cada rato (IP) com 10 mg / kg de AOM solução de trabalho (1 mg / ml em solução salina isotónica, diluída a partir de 10 mg / ml de solução concentrada em dH2O mantida a -20 ° C) . Com base na experiência, esta dose pode ser ajustado entre 7-14 mg / kg e / ou repetida no início da experiência.
....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O tratamento de ratos com AOM e DSS rapidamente e eficazmente modelos colite associada a cancro humano. Hipóteses sobre hereditárias factores que contribuem para a colite cancros associados pode ser facilmente estudado em ratos geneticamente modificados. 13, 16 Alternativamente, o efeito de alvos farmacológicos de colite associada a cancro pode ser estudada utilizando ratinhos de tipo selvagem.
Embora este modelo é altamente valorizado por aqueles interessados no estudo do desen.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por DK089016 e L30 RR030244 (MAC), CA153036 (AS), e P30-DK52574 (para a Universidade Central Washington Research Digestivo Doenças). AIT era uma Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow Formação.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
| Ratos C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Azoximetano (OMA) | Sigma Aldrich | A5486-100mg | Solução stock: diluído a 10 mg / ml em água destilada para ser mantido à temperatura de -20 ° C, tal como 0,5-1 ul. Solução de trabalho: Diluir estoque de 1 mg / ml em isotónica (0,9%), solução salina |
| Dextran sulfato de sódio (DSS) | Consultoria TdB | DB001 | MW 40 kDa (36-50 kDa preparados a partir de outras fontes, são aceitáveis; O mesmo lote deve ser usado para uma única experiência) 6 |
| Coloviewsistema miniendoscopic | Karl Storz | Múltiplo | Veja Becker et al. Uma explicação detalhada de equipamentos e instalação. 11 |
| TPP rápida FilterMax 500 ml Frasco Filtrar, 0,22 PES | Centro-Oeste Científico | TP99500 | Qualquer filtro de tecido de cultura padrão é aceitável |
| Álcool Etílico 200 Prova ASC / USP | Fármaco-AAPER (ou outro) | 11ACS200 | Diluir a 70% em água destilada |
| USP, isoflurano | Butler Abastecimento Saúde Animal | 4029405 | Coloque o rato em frasco de vidro com gaze ou um pequeno pano embebido em anestésico |
| 18G agulha Gavage | Braintree Científica | N-008 | |
| Tampão fosfato salino (PBS) | SigmaAldrich | P5493 | Diluir a 1X (0,01 M) em água destilada |
| Bandeja frio (Tissue Tek Plate II Fria) | Fisher Scientific | NC9491941 | Armazenar a -20 ° C |
| ImageJ Software | NIH (download gratuito) | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Formaldeído (37%) | Fisher Scientific | F79-500 | Diluir a 10% em PBS |
| BD Bacto Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Use hotplate para criar uma solução a 2% em água destilada |
| Molho Miltex Fórceps Eye | MedPlus Inc. | 18-780 | |
| Olho Tesoura Miltex | MedPlus Inc. | 18-1430 | pontos curvos evitar danos ao cólon durante a abertura. |
| Alcian Blue 8GX (pó) | Sigma Aldrich | A5268 | Adicionar 1 g de pó em 100 ml de ácido acético a 3% (3 ml de ácido acético glacial + 97 ml de água destilada) |
| 1 ml seringa de tuberculina com anexo 26 G x 3/8 em bisel da agulha intradérmica | BD | 305946 | Para a injecção de OMA |
Referências
- Ekbom, A. Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N. Engl. J. Med. 323, 1228-1233 (1990).
- Terzic, J. Inflammation and colon cancer. Gastroenterology. 138, 2101-2114 (2010).
- Ullman, T. A., Itzkowitz, S. H.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
