Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria
Summary
Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca mitochondria<sup> 2 +</sup> Handling, mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondriale volume. De procedure voor het verkrijgen van hoge kwaliteit en functionele hart mitochondria wordt ook beschreven.
Abstract
De mitochondriale permeabiliteit transitie poriën (mtPTP) is een niet specifiek kanaal vormt in het binnenste mitochondriale membraan opgeloste stoffen transport met een moleculaire massa kleiner dan 1,5 kDa. Hoewel de definitieve moleculaire identiteit van de porie nog steeds ter discussie, eiwitten zoals cyclofiline D, VDAC en ANT bijdragen aan de vorming mtPTP. Hoewel de betrokkenheid van mtPTP opening in celdood is goed ingeburgerd 1, accumuleren gegevens blijkt dat het mtPTP een fysiologische rol dient tijdens mitochondriale Ca2 + homeostase 2, bio-energetica en redox signalering 3.
mtPTP opening wordt geactiveerd door matrix Ca 2 +, maar de activiteit kan gemoduleerd worden door verschillende factoren zoals oxidatieve stress, adenine nucleotide uitputting hoge concentraties Pi, mitochondriale membraan depolarisatie of ontkoppelen en lange vetzuurketens 4. In vitro, mtPTP opening kan achieved door meer Ca2 + concentratie in de mitochondriale matrix door exogene toevoeging van Ca 2 + (calcium retentievermogen). Wanneer Ca 2 + niveaus binnen mitochondria bereiken van een bepaalde drempel, de mtPTP opent en faciliteert Ca 2 + release, dissipatie van het proton beweging veroorzakende kracht, membraanpotentiaal ineenstorting en een toename van de mitochondriale matrix volume (zwelling), die uiteindelijk leidt tot de breuk van de buitenste mitochondriale membraan en onomkeerbaar verlies van organellen functie.
Hier beschrijven we een fluorometrische assay waarmee een uitgebreide karakterisering van mtPTP opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van drie mitochondriale parameters die gewijzigd wanneer mtPTP opening plaatsvindt: mitochondrial Ca 2 + handling (opname en afgifte, zoals gemeten door Ca2 + concentratie in het testmedium), mitochondriale membraanpotentiaal en mitochondrial volume. De kleurstoffen toegepast voor Ca 2 + meting in het testmedium en mitochondriale membraanpotentiaal zijn Fura FF, een membraan impermeant, ratiometrisch indicator die een verschuiving in de golflengte in aanwezigheid van Ca 2 +, en JC-1, een kationische ondergaat, ratiometrische indicator die groen of rood monomeren aggregaten vormt bij lage en hoge membraanpotentiaal respectievelijk. Veranderingen in de mitochondriale volume worden gemeten door lichtverstrooiing door de mitochondriale schorsing. Sinds hoogwaardige, functionele mitochondriën nodig zijn voor de mtPTP opening test, hebben we ook een beschrijving van de stappen die nodig zijn voor het verkrijgen intact, zeer gekoppeld en functionele geïsoleerde hart mitochondriën.
Protocol
Discussion
De hier gepresenteerde protocol beschrijft de benodigde experimentele stappen permeabiliteit transitie porie opening beoordelen geïsoleerde hart mitochondria (figuur 1 pt figuur 4): de werkwijze voor het isoleren muizenhart mitochondria, de luchtwegen controles die de integriteit en functionaliteit, de mitochondriale parameters gecontroleerd tijdens mtPTP opening en de kleurstoffen gebruikt voor de meting, het opzetten van de spectrofluorimetrische instrumentatie, en de karakterisering…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
Referências
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
