미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정
Summary
미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을 포함<sup> 2 +</sup> 처리, mitochondrial 막 잠재력과 mitochondrial 볼륨입니다. 미토콘드리아 높은 품질과 기능 마음을 얻기위한 절차도 설명되어 있습니다.
Abstract
mitochondrial 투과 전환 기공 (mtPTP)는 1.5 kDa보다 작은 분자 질량과 용질을 운송 할 수있는 내부 mitochondrial 막에 형성되지 않은 특정 채널입니다. 기공의 결정적인 분자 ID가 토론에서 아직 시간이 남아 있기는하지만, 그러한 cyclophilin D, VDAC 및 ANT와 같은 단백질이 형성 mtPTP에 기여하고 있습니다. 세포 죽음의 mtPTP 개방의 참여 잘 하나를 설립하는 동안 증거를 축적하면 mtPTP는 mitochondrial 칼슘 2 + 항상성 2, bioenergetics 및 산화 환원 3 신호를하는 동안 physiologic 역할을 제공했음을 나타냅니다.
mtPTP 영업은 매트릭스 카 2로 실행됩니다 +하지만, 그 활동에는 산화 스트레스, 아데닌 뉴클레오티드 고갈, 파이의 높은 농도, mitochondrial 막 탈분극 또는 uncoupling, 4 장쇄 지방산과 같은 여러 가지 다른 요인에 의해 조절 될 수 있습니다. 체외, mtPTP에서 개방 ACH 할 수 있습니다칼슘 2 +의 외인성 추가 (칼슘 유지 용량)를 통해 mitochondrial 매트릭스 내부에 칼슘 2 + 농도를 증가시켜 재 현 할 수없는 뛰 어. 카 2 미토콘드리아 내부 + 수준의 특정 임계 값에 도달하면, mtPTP가 열리고 카 2 용이 + 릴리스 양자의 동기 힘의 손실, 막 잠재적 인 붕괴와 궁극적으로의 파열로 연결 mitochondrial 매트릭스 볼륨 (붓기)의 증가 외부 mitochondrial 막과 세포 기관 기능의 돌이킬 수없는 손실.
여기 미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mtPTP 개구의 포괄적 인 특성을 허용 fluorometric 분석을 설명합니다. mitochondrial 칼슘 2 + 취급합니다 (칼슘 2로 분석 매체에서 + 농도를 측정 이해와 릴리스), mitochondrial 막 잠재력, 그리고 mitocho : 검정은 mtPTP을 여는가 발생했을 때 변경 아르 세 mitochondrial 매개 변수의 동시 측정을 포함ndrial 볼륨입니다. 카 2 고용 염료는 검정 매체와 mitochondrial 막 잠재력에 + 측정 Fura FF, 막 impermeant, CA 2 +, 그리고 JC-1, 양이온의 존재에 여기 파장의 변화를 겪 ratiometric 표시입니다 각각 낮은 및 높은 막전위에서 녹색 단량체 또는 빨간색 응집체를 형성 ratiometric 표시. mitochondrial 볼륨의 변화는 mitochondrial 정지에 의해 빛이 분산을 기록에 의해 측정됩니다. 높은 품질, 기능 미토콘드리아는 mtPTP 여는 분석에 필요한 때문에, 우리는 그대로 높은 커플 링 기능 절연 심장 미토콘드리아 확보하는 데 필요한 단계를 설명합니다.
Protocol
Discussion
여기에 제시된 프로토콜 미토콘드리아 격리 된 마음 (그림 1과 그림 4)에 투과 전환 기공 오픈을 평가하는 데 필요한 실험 단계를 설명 마우스 마음이 미토콘드리아 분리를위한 절차를, 그들의 무결성과 기능을 보장 호흡기 컨트롤은 mitochondrial 매개 변수는 동안 모니터 mtPTP 영업 및 측정을 위해 사용 된 염료, spectrofluorometric 장비의 설정까지, 그리고 mtPTP 개구의 특성. 이 프로토콜에서…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 HL094536 (BJH)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
Referências
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