Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier
Summary
Ett spektrofluorometrisk protokoll för mätning av mitokondriell permeabilitet övergången pore öppning i isolerad mus hjärta mitokondrier presenteras här. Analysen involverar samtidig mätning av mitokondrier Ca<sup> 2 +</sup> Hantering, mitokondriell membranpotential och mitokondriell volym. Förfarandet för att erhålla hög kvalitet och funktionella hjärta mitokondrier beskrivs också.
Abstract
Den mitokondriella permeabilitet övergång porer (mtPTP) är en icke specifik kanal som bildas i det inre mitokondriemembranet att transportera lösta ämnen med en molekylvikt mindre än 1,5 kDa. Även om den definitiva molekylära identitet por är fortfarande under debatt, proteiner såsom cyklofilin D VDAC och ANT bidrar till mtPTP bildas. Även medverkan mtPTP öppning i celldöd är väl etablerad 1, ackumulerande bevis tyder på att mtPTP serverar en fysiologisk roll under mitokondriell Ca 2 + homeostas 2, bioenergetik och redox signalering 3.
mtPTP öppning utlöses av matris Ca 2 +, men dess aktivitet kan moduleras av flera andra faktorer såsom oxidativ stress, adeninnukleotid utarmning, höga koncentrationer av Pi, mitokondrie membrandepolarisering eller påhängsvagn, och långkedjiga fettsyror 4. In vitro mtPTP öppning kan ACHieved genom att öka Ca 2 + koncentrationen inuti den mitokondriella matrisen genom exogena tillsatser av Ca 2 + (kalcium retentionskapacitet). När Ca 2 + nivåer inuti mitokondrier når en viss tröskel, öppnas mtPTP och underlättar Ca 2 + frisättning, avledning av protonen drivkraft, membranpotentialen kollaps och en ökning av mitokondriella matrisen volym (svullnad) som slutligen leder till bristning av yttre mitokondriemembranet och oåterkallelig förlust av organell funktion.
Här beskriver vi en fluorometrisk analys som möjliggör en omfattande karakterisering av mtPTP öppning i isolerad mushjärta mitokondrier. Analysen innefattar samtidig mätning av 3 mitokondriella parametrar som förändras när mtPTP öppning inträffar: mitokondriell Ca 2 + hantering (upptag och frisättning, såsom mätt genom Ca 2 +-koncentrationen i analysmedium), mitokondriell membranpotential, och mitochondrial volym. De färgämnen som används för Ca 2 + mätning i analysmediet och mitokondriell membranpotential är Fura FF, ett membran ogenomträngligt, kvotmetrisk indikator som genomgår en förändring i excitationsvåglängd i närvaro av Ca 2 +, och JC-1, en katjonisk, ratiometrisk indikator som bildar gröna monomerer eller röda aggregat vid låg och hög membranpotential, respektive. Förändringar i mitokondriernas volym mäts genom att registrera ljusspridning av det mitokondriella fjädring. Eftersom hög kvalitet, funktionell mitokondrier krävs för mtPTP öppna analysen beskriver vi också de åtgärder som krävs för att få intakt, mycket kopplat och funktionell isolerad hjärta mitokondrier.
Protocol
Discussion
Protokollet presenteras här beskriver de nödvändiga experimentella åtgärder för att bedöma permeabilitet öppning övergång por i isolerat hjärta mitokondrier (figur 1 och figur 4): förfarandet för att isolera mus hjärta mitokondrier, de respiratoriska kontroller som säkerställer deras integritet och funktionalitet de mitokondriella parametrar övervakas under mtPTP öppning och färgämnena som används för deras mätning, inrättandet av den spektrofluorometrisk instrum…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av HL094536 (BJH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3030 |
| Trypsin inhibitor (soybean) | Sigma-Aldrich | T9128 |
| Sodium hydrosulfite | Sigma-Aldrich | 71699 |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 |
| Alamethicin | Sigma-Aldrich | A4665 |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Cyclosporin A | Calbiochem | 239835 |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 |
| Tissue grinder Potter-Elvehjem with Teflon pestle 15 ml | Wheaton Industries | |
| Overhead stirrer | Wheaton Industries | 903475 |
| Oxytherm (temperature controlled oxygen electrode) | Hansatech Instruments | |
| QuantaMaster 80 dual emission spectrofluorometer | Photon Technology International, Inc. |
Referências
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D. Cyclophilin D controls mitochondrial pore-dependent Ca2+ exchange, metabolic flexibility, and propensity for heart failure in mice. J. Clin. Invest. 120, 3680-3687 (2010).
- Hom, J. R., Quintanilla, R. A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte. 21, 469-478 (2011).
- Halestrap, A. P. What is the mitochondrial permeability transition pore. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).
- Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O’Rourke, B. Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A. Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).
- Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation. J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).
- Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart. AJP – Heart. 280, 977-983 (2001).
- Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria. J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).
- Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria. Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).
- Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
