Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）
Summary
细胞粘附在基板上的拓扑结构是由可变角度的总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度测量。
Abstract
表面的拓扑结构， 例如，在衬底上生长的细胞中，确定由可变角度总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度。将细胞培养在透明的幻灯片，并与荧光标记物均匀地分布在它们的细胞膜中孵育。照明发生由一个平行的激光束根据变量的总内部反射（TIR）的角度，用不同的穿透深度的瞬态电磁场。荧光图像后，在约10个不同的角度照射的记录允许，计算细胞衬底的距离的精度为几纳米。这样确定的各种细胞株， 例如，肿瘤细胞和恶性细胞少，密合性的差异。此外，可能发生的变化时的细胞粘附化学或光动力治疗可以进行检查。与其他方法相比，超分辨率显微镜的光照射保持活细胞的非常小，并且没有损坏预期发生。
Introduction
当光束传播通过的介质的折射率n 1，满足的第二介质的折射率n 2 <n 1的一个接口，全内反射发生的所有角度，这是大于临界角的入射角ΘΘ=反正弦（N 2 / N 1）。尽管被全反射入射光束的唤起的瞬态电磁场，渗入所述第二介质和呈指数衰减，与从界面的垂直距离z根据I = I 0（z）的易通/天（Θ）。 I（z）的对应的电磁场和d（Θ）的强度，所给出的在波长λ的穿透深度
D（θ）=（λ/4π）（1 2罪2Θ – N 2 2）-1 / 2
据报道在文献1,2中 ，I（0） </sUB> 站 |电子乘以传输系数T（Θ），比n 2 / n 1个与入射光的强度相对应。如果该光束的电场矢量的偏振垂直于入射平面的（ 即所跨越的入射和反射光束的平面），该传输系数由下式给出
T（Θ）= 4余弦2Θ/ [1 – （n 2个 / nL的1）2]
对于检测到的荧光强度在TIRFM测量中，光吸收具有集成的样品的所有层和乘以有关染料的荧光量子收率η，以及检测与立体角Ω。正如以前报道的3，这种强度可以通过以下进行说明
我F（Θ）= AT（Θ）OC（Z）E-Z / D（Θ）DZ
如果所有这些因素是独立的f的ROM的入射角Θ和坐标z均包括在实验常数A.等式3可以解析解，如果荧光基团的浓度c（z）的被认为是几乎恒定的
-或者， 例如 ，在所有坐标Z≥Δ的细胞质内的细胞，从该接口具有的距离Δ。在这种情况下，积分计算从z =Δ到z =∞导致
I F = A C T（Θ）D（Θ）E-Δ/ D（Θ）
-或之间的Z =Δ -吨/ 2和z =Δ+ t / 2只， 即一层薄薄的厚度t内， 例如位于从界面的距离Δ的细胞膜。在这种情况下，可以计算出的荧光强度为
I F =是C T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）
如果tΔ比较小。
正如以前报道的3，图像采集和评估要求
– 在样本激发光的均匀分布的，
-有效性的2层模型（与折光率n 1和n 2分别为在基板和细胞质，分别）。这认为，如果等离子体膜是非常薄的，如果在细胞外介质中的层（细胞和衬底之间）与入射光的波长相比是很小的。
此外，温和的数值孔径（通常为A≤0.90）的显微镜物镜是有利的，以避免由于辐射的各向异性，在近场中的电介质界面亮度偏差。
Protocol
Discussion
描述了一种方法，用于测量细胞衬底与纳米精度的距离。目前，超高分辨率显微镜的方法， 例如 ，基于结构照明7或单分子检测8-10以及受激发射损耗（STED）显微镜是相当大的兴趣。然而，没有这些技术允许的轴向分辨率低于50nm。此外，需要相当高的为50100 W / cm 2的辐照度为单分子的方法和超过3000瓦/厘米2的受激发射损耗显微镜。这超过太阳辐照度（约100毫…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢的土地，巴登-符腾堡州和Europäische联盟的Europäischer全宗献给模具REGIONALE Entwicklung -资金ZAFH光子N，Bundesministerium献给教化和Forschung（BMBF）资助的研究经费。 1792C08和巴登 – 符腾堡州基金会有限公司为融资项目“Aurami”的。
Materials
| Name | Company | Tipo | Comments |
| Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
| Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
| Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
| 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
| Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
| Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
| EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |
Referências
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