Constant Pressure-gesteuerte Extrusionsverfahren zur Herstellung von Nano-Größe Lipidvesikeln

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Extrusionsverfahren zur Herstellung Lipidvesikel von Submikrometer-Abmessungen mit einem hohen Grad an Homogenität. Dieses Verfahren verwendet eine Druck-Steuerung mit gesteuerten Stickstoff Flussraten für Liposomenpräparation. Die Lipid-Vorbereitung^1,2, Wird Liposomen Extrusion, Größe und Charakterisierung Beispiele vorgestellt werden.

Abstract

Liposomen sind künstlich hergestellte Vesikel aus natürlichen und synthetischen Phospholipiden, die weithin als eine Zellmembran imitiert Plattform, um Protein-Protein und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ^3, Drug-Delivery-Monitor ^4,5 und ^{4 studierst} Einkapselung verwendet werden. Phospholipide natürlich erstellen gebogene Lipid-Doppelschichten und zeichnet sich aus einer Micelle. ⁶ Liposomen werden traditionell von Größe und Anzahl der Doppelschichten, dh große unilamellare Vesikel (LUV), kleine einschichtige Vesikel (SUVs) und multilamellare Vesikel (MLV) ⁷ eingestuft. Insbesondere ist die Herstellung von homogenen Liposomen in verschiedenen Größen für das Studium Membrankrümmung, die eine wichtige Rolle bei der zellulären Signalübertragung, Endo-und Exozytose, Membranfusion und Proteintransport ⁸ wichtig. Mehrere Gruppen analysieren, wie sich Proteine ​​verwendet werden, zu modulieren Prozesse, die Membrankrümmung einzubeziehen und somit vorbereiten Liposomen mit Durchmessern <100 bis 400nm bis ihr Verhalten auf Zellfunktionen ^{3 studierst.} Andere konzentrieren sich auf Liposom-Arzneistoff-Verkapselung, Studium Liposomen als Vehikel zu transportieren und liefern ein Medikament von Interesse ^9. Drug-Kapselung erreicht wie während Liposomenbildung ⁹ gemeldet werden. Unsere Extrusionsschritt sollte nicht die verkapselten Wirkstoffs aus zwei Gründen, dh sie sollten (1) Wirkstoffverkapselung vor diesem Schritt erreicht werden und (2) Liposomen sollten ihrer natürlichen biophysikalischen und formstabil bleibt, sicher trägt das Arzneimittel im wässrigen Kern. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, weitere Ziele die Notwendigkeit für eine optimierte Methode, um eine stabile Sub-Mikrometer-Lipidvesikel zu entwerfen.

Dennoch weisen die aktuellen Liposomenzubereitung Technologien (Beschallung ^10, Frost-und ^{Tauwetter-10,} Sedimentation) nicht zulassen, Herstellung von Liposomen mit stark gekrümmten Oberfläche (dh Durchmesser <100 nm) mit hoher Konsistenz und Effizienz ^10,5, die der physischen Begrenztheit Studien eines Emerging Bereich der Membrankrümmung Fernerkundung. Hier präsentieren wir eine robuste Herstellungsmethode für eine Vielzahl von biologisch relevanten Liposomen.

Manuelle Extrusion unter Verwendung gasdichte Spritzen und Polycarbonatmembranen ^10,5 ist eine gängige Praxis, aber Heterogenität wird oft beobachtet, wenn mit Porengrößen <100 nm aufgrund aufgrund der Variabilität der manuellen Druck aufgebracht. Wir verwendeten einen konstanten Druck-gesteuerten Extrusionsvorrichtung, um synthetischen Liposomen, deren Durchmesser im Bereich zwischen 30 und 400 nm herzustellen. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) ^{10, 11} und Elektronenmikroskopie Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) ¹² wurden verwendet, um die Liposomen-Größen zu quantifizieren, wie in unserem Protokoll beschrieben, mit kommerziellen Polystyrol (PS) Perlen als Kalibrier-Standard verwendet. Eine nahezu lineare Korrelation zwischen der verwendeten Porengrößen und der experimentell bestimmten Liposomen beobachtet, was eine hohe Wiedergabetreue der druckgesteuerten Liposomenpräparation erfüllthod. Ferner haben wir gezeigt, dass diese Lipidvesikel Herstellungsverfahren allgemein anwendbar, unabhängig von verschiedenen Größen Liposom ist. Schließlich haben wir auch in einem zeitlichen Verlauf Studie zeigte, dass diese vorbereiteten Liposomen stabil waren für bis zu 16 Stunden. Ein Vertreter in Nano-Größe Liposomenzubereitung Protokoll wird unter Beweis gestellt.

Protocol

1. Liposomenpräparat Abrufen einer 20 ml-Glas mit einem mit Teflon ausgekleideten Deckel. Reinigen Sie alle Glaswaren und Spritzen mit Chloroform vor dem Gebrauch, um eine Kontamination zu verhindern. Übertragen Sie 100 ul Chloroform von Reagenzgüteklasse dem Glasfläschchen mit einer 250 ul luftdichten Glas Spritze. In 30 l Reagens reines Methanol zu dem gleichen Glasfläschchen mit einer 100 ul luftdichten Glas Spritze. Phosphatidylethanolamin (PAPST):: zu einer 2 …

Discussion

Verwenden des Avestin LiposoFast LF-50 Extruder, haben wir gezeigt, wie kleine, synthetischen Liposomen durch ein druckgesteuertes System hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass multilamellare Vesikel spontan nach Liposom Hydratisierung, die Herstellung von kleineren Nanopartikel führen kann. Diese kleinen multilamellare Vesikel wird unweigerlich durch die größere Polycarbonat-Membran Porengröße fließen, wodurch Heterogenität in Lösungen von einschichtigen Vesikeln durch eine große Filterporengröße prod…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter