疾患の病因を研究するツールとしてのニューロンへの抗体のトランスフェクション
Summary
相互作用や細胞内環境における抗体の存在に関連する分子メカニズムに及ぼす影響を調査するための迅速なアプローチが説明されています。この方法は、脂質製剤に基づく非共有結合複合体形成を利用した生細胞への抗体のトランスフェクションが含まれます。技術は不死化細胞株および初代培養細胞に適応可能です。
Abstract
抗体は、生体のシステムで行われている様々なイベントに新たな洞察を得るための機能を提供します。標的タンパク質に特異性の高い抗体を産生する能力が対処しなければ、非常に正確な生物学的な質問のために許可されています。重要なのは、抗体は全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、腫瘍随伴症候群、多発性硬化症（MS）とヒトTリンパ球向性ウイルス1型（HTLV-1）を含むヒトの多くの疾患の病因に関与している脊髄症/熱帯性痙性対麻痺（HAM / TSP）1-9関連付けられています。抗体は、病気が進行中の調査の領域であり、データは抗体および炎症の様々な細胞内分子の結果の間の相互作用は、携帯メッセージング、およびアポトーシス10を変更していることを示唆している原因になる方法。これは、MSとHAM / TSP患者は細胞内のRNA結合タンパク質異種リボ核タンパク質に対する自己抗体を産生することが示されている5月7日 1（のhnRNP A1）は3、9、11。最近のデータは、イントラ神経および表面抗原の両方に対する抗体が病原3、5月9日、11であることを示している。したがって、細胞内抗体の研究を可能にする手順：タンパク質相互作用は、疾患の病因に偉大な洞察力を貸すだろう。
遺伝子は一般的に初代培養細胞や培養細胞株にトランスフェクトされ、細胞内への抗体のトランスフェクションは、しかし抗体構造または貧弱トランスフェクション効率を12の改変によって妨げられている。トランスフェクションの他の方法としては、カチオン性リポソーム（DOTAP / DOPEから成る）とポリエチレンイミン（PEI）に基づく抗体のトランスフェクションを含む;コントロール12と比較して、抗体のトランスフェクションの10倍に減少したどちらも。私たちの研究で行った方法では、陽イオン脂質媒介方法に類似しており、静とhydrを通じて抗体と非共有結合複合体を形成するために、脂質ベースのメカニズムを使用しophobic相互作用13。我々は、非共有結合、静電性および疎水性相互作用を介して抗体を捕捉し、細胞内でそれらを提供することができる脂質製剤であるAB-DeliverIN試薬を利用した。したがって、化学的および遺伝的カップリングは生細胞に機能的な抗体の送達のためには必要ありません。この方法では、さまざまなトレース抗体やタンパク質の局在化実験と同様に、細胞内抗体の分子の結果の分析を行うことができるようになりました：タンパク質相互作用9。
このプロトコルでは、再現性とトランスフェクション効率の高い、急速に神経細胞に抗体をトランスフェクトする方法を示します。一例として、我々はアンチのhnRNP A1および抗IgG抗体を使用します。トランスフェクション効率を簡単に定量化のために、我々はアト-550-NHSとFITC標識IgGで標識した抗のhnRNP A1抗体を使用していました。 Atto550 NHSは高分子吸収と量子yiを持つ新しいラベルですELD。励起源とAtto550用蛍光フィルターはCy3（例：556エム。578）に似ています。また、Atto550は高い光安定性を持っています。 FITC標識IgGは、このメソッドは汎用性であることを示していると依存染めないようにコントロールとして用いた。生成されたこのアプローチは、データは細胞内標的抗原に対する抗体は、ヒト疾患の病因に果たしていることが役割の理解に役立ちます。
Protocol
Discussion
特定の分子とその発現についての仮説をテストするためには、遺伝子および他のベクターは、一般的に細胞にトランスフェクトされる。このプロシージャのユニークな点は、容易に標的細胞に抗体をトランスフェクトする能力である。我々は、重複での5つの別々の実験ごとにこの方法を行った。トランスフェクション効率の結果は、すべての実験間で同様であった。重要なのは、方法は、抗…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、研究開発、医学研究サービス、退役軍人省のOfficeでサポートされています。この研究は、VAメリットレビュー賞（MCL）とテネシー大学ヘルスサイエンスセンター多発性硬化症研究基金によって賄われていた。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | |
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | |
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 |
| PBS | Ambion | 9626 |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | |
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Referências
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