Antistoff Transfeksjon inn Neurons som verktøy for å studere sykdom Patogenese

Summary

En rask metode for å undersøke interaksjoner og effekter på molekylære mekanismene knyttet til nærværet av antistoffer i en intracellulær miljø er beskrevet. Fremgangsmåten innebærer transfeksjon av antistoffer i levende celler ved hjelp av et ikke-kovalent kompleks formasjon basert på en lipid formulering. Teknikken er tilpasningsdyktig til udødeliggjort cellelinjer og primære celler.

Abstract

Antistoffer gi muligheten til å få romanen innsikt i ulike arrangementer som finner sted i levende systemer. Evnen til å produsere svært spesifikke antistoffer mot target proteiner har åpnet for svært presise biologiske spørsmål tas opp. Viktigere, har antistoffer vært implisert i patogenesen av en rekke humane sykdommer inkludert systemisk lupus erythematosus (SLE), revmatoid artritt (RA), paraneoplastiske syndromer, multippel sklerose (MS) og human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) assosiert myelopati / tropisk spastisk paraparese (HAM / TSP) ^1-9. Hvordan antistoffer forårsake sykdom er et område med pågående etterforskning, og data tyder på at interaksjoner mellom antistoffer og ulike intracellulære molekyler resultater i betennelser, endret cellulær messaging, og apoptose ^10. Det har blitt vist at pasienter med MS og HAM / TSP produserer autoantistoffer til det intracellulære RNA bindingsprotein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) ^{3, 5-7, 9, 11.} Nyere data indikerer at antistoffer til både intra-neuronal og overflateantigener er sykdomsfremkallende ^{3, 5-9, 11.} Dermed, en prosedyre som gjør det mulig for studiet av intracellulær antistoff: ville protein interaksjoner låne stor innsikt i sykdommen patogenesen.

Gener er ofte transfekteres i primære celler og cellelinjer i kultur, har imidlertid transfeksjon av antistoffer i celler blitt hindret av endring av antistoff struktur eller dårlig transfeksjon effektivitet ^12. Andre metoder for transfeksjon er antistoff transfeksjon basert på kationiske liposomer (bestående av DOTAP / DOPE) og polyethylenimines (PEI), som begge som resulterte i en ti-ganger reduksjon i antistoff transfeksjon forhold til kontroller ^12. Metoden utføres i vår undersøkelse er lik kationiske lipid-medierte metoder og benytter et lipid-basert mekanisme for å danne ikke-kovalente komplekser med antistoffer gjennom elektrostatisk og hydrophobic interaksjoner ^13. Vi utnyttet Ab-DeliverIN reagens, som er et lipid formulering som kan fange antistoffer gjennom ikke-kovalente elektrostatiske og hydrofobe interaksjoner og levere dem inne i celler. Således kjemisk og genetisk koblinger er ikke nødvendig for levering av funksjonelle antistoffer i levende celler. Denne metoden har gitt oss mulighet til å utføre ulike antistoff sporing og protein lokalisering eksperimenter, samt analyser av de molekylære konsekvensene av intracellulær antistoff: protein interaksjoner ^9.

I denne protokollen, vil vi vise hvordan du transfektere antistoffer i nevroner raskt, reproduserbart og med en høy grad av transfeksjon effektivitet. Som et eksempel vil vi bruke anti-hnRNP A1 og anti-IgG antistoffer. For enkel kvantifisering av transfeksjon effektivitet brukte vi anti-hnRNP A1 antistoffer merket med Atto-550-NHS og FITC-merket IgG. Atto550 NHS er en ny etikett med høy molekylvekt absorpsjon og quantum yield. Eksitasjon kilde og fluorescerende filtre for Atto550 ligner Cy3 (eks. 556 Em. 578). I tillegg har Atto550 høy fotostabilitet. FITC-merket IgG ble brukt som en kontroll for å vise at denne metoden er allsidig og ikke fargestoff avhengige. Denne tilnærmingen og dataene som er generert vil bistå i forståelse av rollen som antistoffer til intracellulære mål antigener kan spille i patogenesen av menneskelige sykdommer.

Protocol

1. Antibody Labeling (Figur 1) Gjør 0,1 M NaHCO 3 buffer: 8,4 g NaHCO 3 29,2 g NaCl 1 liter H 2 O Bring bufferen opp til en pH på 8,4 med denne løsning (10,6 g Na 2 3 CO, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). Legg 35 ul Atto550 NHS til 70 pl anti-hnRNPA1 og 500 pl NaHCO 3 buffer og roterer i 1 time ved romtemperatur. Etter den timelange rotasjon, injiserer blandingen i en dialyz…

Discussion

For å teste hypoteser om spesifikke molekyler og deres uttrykk blir gener og andre vektorer som vanligvis transfektert inn i cellene. Det unike med denne prosedyren er muligheten til enkelt transfektere antistoffer i målcellene. Vi utførte denne metoden i fem separate eksperimenter hver i duplikater. Transfeksjon effektivitet resultatene var lik blant alle eksperimenter. Viktigere, muliggjør metoden oppføring av antistoffer inn i cellen uten å endre antistoff struktur eller funksjon. Videre, med bruk av fluorescen…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Fluorescent Microscope AxioObserver A1	Zeiss
Axiovision version 4.2	Zeiss
Anti-rhnRNPA1	Abcam	Ab4791
FITC labeled anti-rIgG	OZ Biosciences	AI20100
Atto550 NHS ester	Sigma	92835
Ab-DeliverIN	OZ Biosciences	AI20100
DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics	Gibco	11320-033
Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides	BD	354632
Multi-Purpose Rotator	Scientific Industries Inc	Model 151
DAPI Mounting Media	Millipore	S7113
PBS	Ambion	9626
Dialyzer	Thermo Fisher Scientific	66380
Amicon Ultra-0.5	Millipore	UFC501096
Paraformaldehyde (4% solution)	Electron Microscopy Sciences
Nano-Drop	Thermo Fisher Scientific