Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価
1Department of Microbiology and Immunology,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology,Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology,SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center,Louisiana State University Health Sciences Center
Summary
phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。
Abstract
細胞の運動性は単細胞と多細胞生物の両方にとって重要な生物学的プロセスである。これは、ほんの数1,2,3役割に言及し、組織の発達、免疫監視および創傷治癒には不向きな条件からだけでなく、多細胞生物に離れて栄養源に向かって、または単細胞生物の動きのために不可欠です。このプロセスの規制緩和は重大な、神経、心血管および免疫疾患につながるだけでなく、腫瘍の形成と拡散4,5を悪化させたことができます。分子、アクチンの重合と受容体のリサイクルは、セル6,7,8の前方への移動を駆動する携帯電話の拡張（葉状仮足）の作成 に重要な役割を果たすことが示されている。しかし、細胞の遊走についての多くの生物学的な疑問は未解決のままです。
ヒトの健康と疾患における細胞の運動性のための中心的な役割は、特定のMECを理解することの重要性を強調hanismsは、このプロセスに関与しており、特に重要な細胞の運動性を評価するための正確な方法になります。顕微鏡は、通常の細胞の動きを視覚化するために使用されています。しかし、細胞は運動性細胞の定量的な時間経過のムービーを作成するために高価なカメラとソフトウェアを必要とするリソースのかかるプロセスで細胞遊走の定量的な測定を行うことではなく、徐々に移動します。したがって、費用対効果が細胞移動の定量的な測定を実行する能力、非骨の折れる、共通実験装置を利用し、多くの研究者のための大きい必要があります。
phagokineticトラック運動性アッセイは、金コロイドで被覆されたガラスカバースリップ9,10に測定可能なトラックを作成し、そのパスから金粒子をクリアする移動細胞の能力を利用しています。自由に利用できるソフトウェアを使用して、複数のトラックが統計的要件を達成するために、各治療のために評価することができます。アッセイは、評価するために利用することができがん細胞など多くの細胞型、11,12、線維芽9、好中球13、骨格筋細胞14、ケラチノサイト15トロホブラスト16、内皮細胞17、および単球の運動性10,18-22。プロトコルは、クエン酸ナトリウムによって塩化金酸の還元金（Au 3 +）によって生成された金ナノ粒子（金°）で被覆されたスライドの作成 が含まれます。この方法は、1951年23インチ Turkevich らによって開発された後、Frens らによって1970年代に改善された。24,25。この化学還元工程の結果として、金粒子（直径10〜20 nm）は、反応混合物から沈殿させ、その後、細胞移動の解析9,26,27で使用するための準備ができているカバーガラスに適用することができます。
一般的に、phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞の運動性、迅速かつ簡単に定量的な尺度である。加えて、それ時間経過イメージング、ならびに研究者のニーズに応じて他の用途に適さない種類の細胞で使用するために、単純なハイスループットアッセイとして利用することができる。一緒に、定量的に高価な顕微鏡やソフトウェアを必要とせずに、複数の種類の細胞の細胞の運動性を測定する能力は、一般的な実験器具や薬品の使用とともに、phagokineticトラック運動分析セルラーを理解することに関心を持つ科学者のための堅実な選択肢作る運動性。
Protocol
1。ゼラチンコートしたカバーガラスの作製滅菌したプラスチック製100 mmディッシュ（ES）の場所は、酸洗浄したカバーグラス（直径15ミリメートル）。皿あたり8から9カバーガラスを置き、彼らがお互いに触れたり、お皿の両側いないことを確認してください.. 注：カバーガラス、針やピンセットは可能混入微生物、ならびに運動性を含む細胞機…
Representative Results
示されている単一電池（我々の実験から単球を図2に示されている）によってクリアトラック領域を示す光学顕微鏡下で撮影した画像の一例です。非運動性の細胞は、特徴的な、小さな楕円形またはこれらの刺激細胞（ 図2Aおよび2B）のための運動の低い基底レベルを示す自身の周りに円形の管を作成します。これとは対照的に、非常に運動性の細胞[私た…
Discussion
この記事で紹介phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞遊走の定量分析のためのシンプルで非常に効果的な方法です。複数の細胞型が9月17日を分析することができるので、この方法は、複数の分野にまたがる広範な潜在的な用法を持っています。コロイド金コートしたカバーガラスの使用は、移動セルでクリアトラック領域の測定が可能になる。アッセイは、細胞の運動性で異な?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国立衛生研究所（AI050677、HD-051998、およびGM103433）、マルコム·ファイスト心臓血管研究フェローシップ、アメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（10PRE4200007）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Glass Coverslips (15 mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. |
Referências
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
- Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
- Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
- Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
- Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
- Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
- Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).
- Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
- Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
- Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
- Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
- Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
- McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
- Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
- Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
- Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
- Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
- Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
- Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
- Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
- Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
- Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
- Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
- Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).
- Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
- Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
- Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
- Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).
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Citar este artigo
Nogalski, M. T., Chan, G. C., Stevenson, E. V., Collins-McMillen, D. K., Yurochko, A. D. A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay. J. Vis. Exp. (70), e4165, doi:10.3791/4165 (2012).