Kvantitativ, Real-time analyse af base excision reparation aktivitet i cellelysater Udnyttelse Læsionssynligheden-specifikke Molecular Beacons
Summary
Beskriver vi en fremgangsmåde til kvantitativ real-time måling af DNA-glycosylase og AP-endonuclease aktiviteter cellekerner lysater. Assayet giver hastigheder af DNA-reparation aktivitet kan underkastes kinetisk analyse og kan tilpasses til kvantificering af DNA-reparation aktivitet i væv og tumorer lysater eller oprensede proteiner.
Abstract
Beskriver vi en fremgangsmåde til kvantitativ real-time måling af DNA-glycosylase og AP-endonuclease aktiviteter cellekerner lysater under anvendelse base excision reparation (BER) Molecular Beacons. Substratet (fyr) består af en deoxyoligonukleotid indeholdende en enkelt base læsion med en 6-carboxyfluorescein (6-FAM)-delen konjugeret til 5'-enden og en Dabcyl del konjugeret til 3'-enden af oligonukleotidet. BER molekylære mærke er 43 baser i længde og sekvens udformet til at fremme dannelsen af en stem-loop-struktur med 13 nukleotider i sløjfen og 15 basepar i stammen 1,2. Når den er foldet i denne konfiguration 6-FAM-delen standses ved Dabcyl i en ikke-fluorescerende måde via Forster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Læsionen er anbragt således, at efter grundlæggende læsion fjernelse og strengspaltning resterende fem baser oligonukleotid indeholdende 6-FAM del frigives fra stilken. Frigive ennd frigørelse fra quencher (dabcyl) resulterer i en forøgelse af fluorescens, som er proportional med niveauet af DNA-reparation. Ved at samle flere læser af fluorescens værdier tidstro vurdering af BER aktivitet er mulig. Anvendelse af standard kvantitativ realtids-PCR instrumenter tillader den samtidige analyse af flere prøver. Udformningen af disse BER Molecular Beacons med en enkelt base læsion, er egnet til kinetiske analyser, BER kvantificering og inhibitor validering og kan tilpasses til kvantificering af DNA-reparation aktivitet i væv og tumorer cellelysater eller oprensede proteiner. Analysen af BER aktivitet i tumor lysater eller væv suger ved hjælp af disse molekylære beacons kan gælde for funktionelle biomarkør målinger. Yderligere analyse af BER-aktivitet med oprensede proteiner under anvendelse af denne kvantitative assay tilvejebringer en hurtig, high-throughput fremgangsmåde til opdagelse og validering af BER-inhibitorer.
Protocol
Discussion
Der er over 600 citater anvender udtrykket "molekylære mærke" til detektion og kvantificering af adskillige molekyler og enzymatiske aktiviteter, herunder helicase-aktivitet 6, DNA-polymerase-aktivitet 7,8, DNA-ligase-aktivitet 9, telomeraseaktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 og DNA / RNA hybrider 12, blandt mange andre. Ud over anvendelse af Molecular Beacons til måling af DNA-reparation, der er opført ovenfor, har vi og andre viste a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Pittsburgh Foundation og National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629; ES019498] til RWS. Støtte til UPCI lentiviral faciliteten blev stillet til rådighed RWS fra Cancer Center Support Grant fra National Institutes of Health [P30 CA047904]. Der blev også leveret af University of Pittsburgh Institut for Farmakologi & Chemical Biology til DS. Der blev også leveret af ESTRO til CV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
Referências
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
