Quantitative, Echtzeit-Analyse der Base Excision Repair Aktivität in Zelllysaten Verwendung läsionsspezifischen Molecular Beacons
Summary
Wir beschreiben ein Verfahren für die quantitative Echtzeit-Messung der DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten in Kerntransfer-Lysaten. Der Test liefert Raten von DNA-Reparatur-Aktivität zugänglich kinetische Analyse und ist anpassungsfähig für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität im Gewebe und Tumor-Lysaten oder mit gereinigten Proteinen.
Abstract
Wir beschreiben eine Methode zur quantitativen Echtzeit-Messung von DNA-Glycosylase und AP-Endonuklease Aktivitäten im Zellkern-Lysaten mit Basenexzisionsreparatur (BER) Molecular Beacons. Das Substrat (Beacon) aus einem Deoxyoligonukleotid enthaltend eine einzelne Base Läsion mit einem 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) konjugiert an die 5'-Ende und ein DABCYL-Rest konjugiert an das 3'-Ende des Oligonukleotids umfaßt. Die BER Molecular Beacon ist 43 Basen Länge und die Sequenz wurde entwickelt, um die Bildung einer Stamm-Schleifen-Struktur mit 13 Nukleotiden in der Schleife und 15 Basenpaaren in dem Schaft 1,2 zu präsentieren. In dieser Konfiguration geklappt und der 6-FAM-Einheit durch Dabcyl in einem nicht-fluoreszierenden Weise über Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4 abgeschreckt. Die Läsion ist so, dass die folgenden Basis-Läsion Entfernung und Strangbruch die restlichen 5 Basis-Oligonukleotid mit der 6-FAM-Rest vom Stamm gelöst wird positioniert. Lassen Sie einRunde Ablösung von den Quencher (Dabcyl) führt zu einer Zunahme der Fluoreszenz, die im Verhältnis zu der Ebene der DNA-Reparatur. Durch das Sammeln mehrerer liest der Fluoreszenz-Werte, ist eine Echtzeit-Bewertung von BER-Aktivität möglich. Der Einsatz von Standard quantitative Echtzeit-PCR-Instrumente erlaubt die gleichzeitige Analyse zahlreicher Proben. Das Design dieser BER Molecular Beacons mit einer einzigen Basisstation Läsion, zugänglich ist, um kinetische Analysen, Quantifizierung und BER-Inhibitor Validierung und anpassbar ist für die Quantifizierung der DNA-Reparatur-Aktivität in Gewebe und Tumor Zelllysaten oder mit gereinigten Proteinen. Die Analyse der BER-Aktivität in Tumorlysaten oder Gewebe saugt Verwendung dieser Molecular Beacons kann für funktionelle Biomarker Messungen. Ferner stellt die Analyse von BER-Aktivität mit gereinigten Proteinen mit diesen quantitativen Assay eine schnelle, High-Throughput-Verfahren zur Identifizierung und Validierung von BER-Inhibitoren.
Protocol
Discussion
Es gibt über 600 Zitate mit dem Begriff "Molecular Beacon" zur Detektion und Quantifizierung zahlreiche Moleküle und enzymatische Aktivitäten, einschließlich Helikaseaktivität 6, DNA-Polymerase-Aktivität 7,8, DNA-Ligase Aktivität 9, Telomerase-Aktivität 10, 11 DNA-Photolyase Aktivität und DNA / RNA-Hybride 12, unter vielen anderen. Neben der Verwendung von Molecular Beacons für die Messung der DNA-Reparatur oben genannten Aktivitäten, haben wir …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zu RWS Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Pittsburgh-Stiftung und der National Institutes of Health (NIH) [;; CA148629 ES019498 GM087798] unterstützt. Die Unterstützung für die UPCI Lentivirale Fazilität wurde zu RWS durch die Cancer Center Support Stipendium der National Institutes of Health [P30 CA047904]. Unterstützung wurde auch von der University of Pittsburgh Abteilung für Pharmakologie und Chemische Biologie an DS zur Verfügung gestellt. Unterstützung wurde auch durch ESTRO zu Lebenslauf zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
Referências
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