Une procédure optimisée pour Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) Isolement du système nerveux autonome progéniteurs neuronaux de viscères de souris sur le fœtus

Summary

Une procédure optimisée pour purifier la crête neurale-dérivés progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris est décrite. Cette méthode tire parti d'expression parmi les allèles rapporteurs fluorescents d'isoler des populations distinctes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). La technique peut être appliquée pour isoler les sous-populations neuronales au cours du développement ou de tissus adultes.

Abstract

Au cours du développement de la crête neurale (NC) dérivés de progéniteurs neuronaux migrer loin du tube neural pour former ganglions autonomes dans les organes viscéraux comme l'intestin et du tractus urinaire inférieur. Les deux cours du développement et dans les tissus matures ces cellules sont souvent très dispersés à travers les tissus de telle sorte que l'isolement des populations discrètes en utilisant des méthodes comme la capture laser micro-dissection est difficile. Ils peuvent cependant être directement visualisée par l'expression de journalistes fluorescentes chassés de régions régulatrices de gènes spécifiques des neurones comme la tyrosine hydroxylase (TH). Nous décrivons une méthode optimisée pour des rendements élevés de TH viable + de progéniteurs neuronaux à partir de tissus fœtaux de souris viscérales, y compris l'intestin et inférieure du tractus urogénital (LUT), fondée sur la dissociation et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Le gène codant pour la Th enzyme limitante pour la production de catécholamines. Entériques progéniteurs neuronaux commencent à exprimer TH durIng leur migration dans l'intestin du fœtus ¹ et TH est également présent dans un sous-ensemble de neurones des ganglions pelviens adultes ^2-4. La première apparition de cette lignée et la distribution de ces neurones dans d'autres aspects de la LUT, et leur isolement n'a pas été décrite. Progéniteurs neuronaux exprimant TH peut être facilement visualisées par l'expression de l'EGFP dans des souris porteuses du transgène construction Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc ^1. Nous imagée expression de ce transgène dans des souris fœtales afin de documenter la distribution de TH + cellules dans la LUT développer à 15,5 coït jours après (DPC), désignant le matin de la détection prise de 0,5 jpc, et a observé que un sous-ensemble des progéniteurs neuronaux dans la coalescence pelvienne ganglions expresse EGFP.

Pour isoler TH + LUT progéniteurs neuronaux, nous avons optimisé les méthodes qui ont été initialement utilisés pour purifier les cellules souches neurales de crête de l'intestin de souris fœtale ^2-6. Efforts antérieurs visant à isoler NC dérivés populations invoquésdigestion avec un cocktail de collagénase et de la trypsine pour obtenir des suspensions cellulaires pour la cytométrie en flux. Dans nos mains ces méthodes ont produit des suspensions cellulaires de la LUT avec la viabilité relativement faible. Compte tenu de l'incidence déjà faible de progéniteurs neuronaux dans les tissus fœtaux LUT, nous avons décidé d'optimiser les méthodes de dissociation de telle sorte que la survie des cellules dans les dissocie finales serait augmenté. Nous avons déterminé que douce dissociation dans Accumax (Cell Technologies innovantes, Inc), filtrage manuel, et le débit de tri à de faibles pressions nous ont permis d'atteindre la survie constamment supérieur (> 70% des cellules totales) avec des rendements ultérieurs de progéniteurs neuronaux suffisants pour l'analyse en aval. La méthode que nous décrivons peut être largement appliquée à isoler une variété de populations neuronales foetales à partir soit ou adulte tissus murins.

Protocol

1. Préparation des médias (Toutes les étapes de fait dans la hotte de culture tissulaire) Mélanger le suivant: 44 L-15 ml de milieu, 0,5 ml 100X pénicilline / streptomycine (P / S), 0,5 ml à 100 mg / ml de sérumalbumine bovine (BSA), 0,5 ml de HEPES 1M, 5 ml de tissus de qualité de l'eau de la culture. Assurez-vous de mélanger BSA et P / S avant d'ajouter. Ce volume devrait être suffisant pour la dissociation d'un maximum de cinq différents types de tissus. Ce support sera utilisé à l…

Discussion

Lignes journaliste de souris exprimant journalistes fluorescentes sont de plus en largement disponibles grâce à des efforts multiples dans le milieu de la génétique murine ^1,8,9. En conséquence, la méthode de la dissociation illustré ici peut être largement appliquée pour l'isolement de sous-types neuronaux distincts basés sur les profils d'expression des neurotransmetteurs ou des récepteurs de tissus fœtaux soit ou adulte. Alors que nous avons optimisé cette méthode basée sur l'exp…

Materials

Reagent Name	Vendor	Catalog number	Comments
Accumax	Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies)	A7089-100ML	Store frozen in 1 ml aliquots
DNase I	Sigma	D-4527	Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5)
10X PBS pH 7.4	Gibco	70011-044	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
10X HBSS w/o Ca or Mg	Gibco	14185-052	Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	21083027
Penicillin /Streptomycin 100X	Gibco	15140-133	Store aliquoted at -20 °C
BSA	Sigma	A3912-100G	Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl	Lonza	17-737E
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane	Sefar America	3-38/22	Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood.
7-AAD	Invitrogen	A1310	1 mg/ml
TRIzol LS	Invitrogen	10296-028
5 ml polystyrene tubes	Falcon	352058
15 ml conical tubes	Corning	430790
Fine Dissecting Forceps	Fine Science Instruments	11251-30	Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm
Dissecting Spoon	Fine Science Instruments	10370-18