LabVIEW som drivs Novel nanoliter Osmometer för Ice protein Undersökningar

Summary

Ice bindande proteiner (IBPS), även kända som antifrysproteiner, inhiberar is tillväxt och är en lovande tillsatsmedel för användning vid kryokonservering av vävnader. Det viktigaste verktyget som används för att undersöka IBPS är nanoliter osmometer. Vi utvecklade ett hem utformad kylsteg monterad på ett optiskt mikroskop och kontrolleras med hjälp av en specialbyggd LabVIEW rutin. Den nanoliter osmometer beskrivs här manipulerade provtemperaturen i en ultra-känslig sätt.

Abstract

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocol

0. Preliminära förfaranden Glaskapillär för lösning injektion. Med hjälp av en kapillär avdragare (Narishige, Tokyo, Japan), förbereda en skarp pipett med en fin öppning från en glaskapillär mikro rör (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Storleken på öppningen bör verifieras genom att leda luft genom kapillären för att erhålla fina bubbling i rent vatten. Om kapillären är stängd, så kan man öppna den genom att bryta dess kant. Detta kan åstadkommas genom att trycka eller skrapa försiktigt mot vattnet innehållande rörväggarna. Förbered kapillären så att öppningen nästan är blockerad men tillräckligt öppna för att tillåta bildning av sub-millimeter bubblor. Koppar-skiva rengöring. Sonikera koppar skivor för 10 min i 0,1% Micro-90 tvål (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), tvätta sedan med dubbeldestillerat vatten. Introducera skivorna till en isopropanol (teknisk) lösning och sonikera igen under 10 min. Finbundsförvant, torka skivor med filtrerad luft. Denna reningssteg är avgörande för att undvika IBP förorening mellan experiment. Dubbla lager täckglas församling. En täckglas församling var beredd att medge prov observation utan kondensering fukt på omslaget glasytan. Detta uppnåddes genom att placera en Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikel (2 mm i diameter) mellan två täckglas som sedan limmats med en limpistol. Denna konfiguration förhindrade kondens som kan blockera vyn när provet kyldes till låga temperaturer och bort behovet av att blåsa torr luft på observationsfönstret. 1. Kylning Stage Set-up Anslut inloppet vattenflöde och utlopp kylsteget till 4 mm innerdiameter Tygon-rör (Saint-Gobain, Paris, Frankrike), och anslut vattenslangen flödet inlopp till en vattenpump. Anslut en 4 mm inre rördiameter Tygon till inloppet av kylningssteget to leverera torr luft. Luften torkades med användning av en in-line-Drierite-kolonn. Manövrera luft och vatten pumpar. Notera att kylelementen inte ska köras utan en kylfläns. Slå på temperaturkontroll, kamera och LabVIEW rutin. 2. Provberedning Placera ett 3-4 pl droppe av immersionsolja B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på baksidan av en 7 mm diameter koppar skiva med 500 pm hål borrade genom skivan. Placera koppar skivan på kylsteg med immersionsolja nedåt. Anslut kapillärröret (den trubbiga kanten) till en 0,7 mm innerdiameter Tygon rör anslutet vid den andra änden till en 2 ml glasspruta (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland). Före användning av kapillärröret, kontrollera den lilla öppningen av kapillären för att säkerställa att öppningen är en lämplig storlek (se Inledande förfaranden). Långsamt in glass kapillär i den förberedda IBP proteinet provröret (2,4 M Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl 2 och 25 mM Tris-HCl vid pH 8, se referens 10 för beredning detaljer) och dra glasspruta tills glaskapillär innehåller 0,1 il av proteinlösningen. Börja videoinspelning via LabVIEW programvara. Sätt den skarpa kanten av glaset kapillären (innehållande proteinlösningen) i ett av hålen i koppar skivan på kylningssteget. Medan observerar genom mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x mål), försiktigt penetrera lagret immersionsolja med glaskapillär spetsen och tryck på glassprutan (mycket fint) för att leverera en liten mängd (~ 10 NL) av proteinet lösning för att skapa en 200 um droppe. Täck hålet i kyl scenen med dubbla lager täckglas församling (se preliminära förfaranden). 3. TH-aktiviteten Mätning Press kyl-knappen och ställ in temperaturen till -40 ° C. Initialt kommer lösningsdroppe vara klar. Vid låga temperaturer, typiskt i intervallet -30 ° C till -35 ° C, droppen ändrar färg, vilket indikerar att lösningen har frysts. Omedelbart efter det att provet har frusit, öka temperaturen långsamt tills huvuddelen isen börjar smälta. En gradvis ökning av temperaturen är nödvändig för att undvika överskridande av den temperatur som kan leda till fullständig smältning av provet. Byt till en 50x objektiv och börjar smälta isen genom att justera temperaturen. Denna justering är interaktiv, och de slutliga stegen utförs typiskt med användning av små temperatur steg 0,002 ° C. Fortsätt att smälta tills en enda kristall kvarstår. Den slutliga storleken för kristallen bör ligga runt 10 | im. Den högsta temperatur vid vilken smältning har upphört bestäms vara smältpunkten och bestäms noggrant i den senare videoanalys skede. <li> Ställ in temperaturen till ett fåtal hundradelar av en grader celsius under smältpunkten av kristallen och börja en temperaturramp med en 10 min fördröjning. Justera ramp takt som önskas. Under denna tid, kommer kristallen att utsättas för IBPS. Vid fullbordande av 10 min exponering tid, kommer temperaturen sjunka automatiskt under kontroll av LabVIEW rutinen. Observera kristall form när temperaturen sjunker. Vid någon punkt, kan det plötsliga utbrottet av iskristallen observeras. Den temperatur vid vilken detta inträffar noteras som kristallen brast temperaturen. Använda video för att bestämma den exakta smältpunkten och skuren temperaturen. Först med hjälp av videoanalys, hitta den exakta smältpunkten. Minns att den högsta temperatur vid vilken smältning har upphört bestäms vara smältpunkten. Dokumentera detta smältpunkt i ett kalkylprogram. Sedan bestämmer den exakta temperaturen kristall brast, och dokumentera detta värdesamt. Skillnaden mellan smältpunkten och fryspunkten, eller kristall brista temperatur, är den termiska hysteres aktiviteten IBP lösningen. 4. Mätning av Tidsberoende TH aktivitet Följ protokollet beskrivet i avsnitt 3,1-3,3 att framställa en enda kristall av is. Efter bildning av kristallen, ställa in fördröjningstiden för rampen såsom önskas, och slå på rampen. Temperaturen kommer att sjunka till en fast ränta (enligt operatörernas krav) automatiskt när rampen fördröjningstiden har passerat. Dokumentera den temperatur vid vilken kristallen skuren uppträder. Beräkna exponeringstiden (tiden mellan kristallbildning och kristallen skur). Upprepa experimentet för olika fördröjningstider och plotta TH-aktiviteten som en funktion av exponeringstiden för att utvärdera den tid beroende av TH-aktiviteten.

Representative Results

Mätning av TH tidsberoende Den LabVIEW-drivna nanoliter osmometer underlättar utförandet av noggranna mätningar TH aktivitet. Den konstant temperatur reduktionshastighet tillät mätning av TH tidsberoende. Den exakta temperatur aktiverad av nanoliter osmometer var avgörande för dessa experiment. Exponeringstiden för en iskristall till IBPS i lösning definieras som tidsperioden från bildandet av kristallen (slutet av smältningsprocessen) tills den plötsliga ökningen av is runt kristallen (kristall skur). Vi fann att exponeringstiden för iskristallerna till IBPS avgörande påverkat TH-aktiviteten. Korta perioder av IBP exponering (några sekunder) gav en låg TH-aktiviteten i MP IBP-GFP-lösning (2,4 M) (Figur 5). TH-aktiviteten ökade med IBP exponeringstid tills den nådde en platå vid 4 minuter IBP exponering. Vid högre IBP koncentrationer plattanAU nåddes vid kortare tider. Figur 1. Visar schematiskt IBPS adsorberas till is. Antagen med tillstånd från 10. Figur 2. Kylsteget. A) Ansluts till rör på mikroskopet. B) Utan den övre ledningen. C) Principschema. Figur 3. Skärmdump på LabVIEW-gränssnittet. ClICK här för att visa större bild. Figur 4. Temperaturstabilitet graf. Temperaturregulatorn sattes för att sänka temperaturen 0,01 ° C var 15 sek. Figur 5. Smp IBP TH-aktiviteten som en funktion av iskristall exponeringstid för IBPS. Varje tidpunkt är medelvärdet av 3-6 experiment.

Discussion

Detta arbete demonstrerar driften av en datorstyrd nanoliter osmometer som möjliggör noggranna mätningar av TH-aktiviteten med utomordentlig temperaturkontroll. I varje temperatur-känsligt system, måste oönskade temperaturgradienter undvikas. För att undvika temperaturgradienter i apparaten som presenteras här, skall testlösningen droppen placeras i mitten av ett hål i kopparskivan kylsteget (steg 2,7). Dessutom bör den enda kristallen vara i centrum av droppen snarare än nära kanterna (i de flesta fall kommer detta att ske spontant). Tidsberoendet beskrivna visar att kylningshastigheten kan påverka TH avläsningar. Sålunda föreslår vi inklusive en rapport av den tid under vilken kristallen exponerades för lösningen före kylning, liksom kylningshastigheten. Vi väntade typiskt 10 min före ramp ner temperaturen vid 0,01 ° C steg vardera 4 sek.

De LabVIEW-kontrollerade samarbeteoling etappen anpassad för användning med ett omvänt mikroskop som mikrofluidikanordningar kan termiskt manipuleras. Detta system underlättar att testa lösningen utbyte som inbegriper iskristaller och IBPS etiketten EGFP ^{9, 10, 16.} LabVIEW-styrda systemet kan anpassas till en Clifton steg genom att ansluta 3040 temperaturregulator via en utsedd anpassning elektrisk krets. Ett sådant system används i Davies labbet ^17. Den LabVIEW programvara och den utsedda anpassa elektrisk krets design för Clifton scenen finns tillgängliga på begäran.

Sammanfattningsvis beskriver vi en nanoliter osmometer som underlättar känsliga kontroll och manipulation av temperatur och graden av temperaturen öka och minska (med 0,002 ° C känslighet), samordnas med en video-gränssnitt via en LabVIEW rutin för realtidsanalys. Detta system kan utföra reproducerbara kurs-kontrollerade experiment som är important för att undersöka kinetiken för IBP interaktioner med is. Sådana experiment kan ta flera långa omdebatterade frågorna kring verkningsmekanismen för IBPS.

Materials

Name	Company	Catalog Number/model	Comments
Immersion oil Type B	Cargille Laboratories	16484
Drierite	W.A. Hammond Drierite	043063 2270g
Micro 90 cleaning solution	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillary puller	Narishige	PB-7
Glass capillary tubes	Brand GNBH	7493 21	75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller	Newport, Irvine, California, United States	Model 3040	Model 3040
Light microscope	Olympus	Model BH2
10x objective	Olympus		S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective	Nikon		CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera	Provideo	CVC-140
Tygon tubes	Saint-Gobain, Paris, France		Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Germany	7 10227
GPIB-PCI card	National instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407	National instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
LabVIEW System Design Software	National instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
DiVx Author software	DiVx LLC, San Diego, CA, USA