実験室規模の合成クモの糸生産
Summary
クモの糸の傑出した機械的および生化学的特性にもかかわらず、この材料は、従来の手段によって大量にで収穫されたすることはできません。ここで我々は次世代の生体材料としてクモの糸生産とその使用方法を勉強し調査官するための重要なプロセスである人工的なクモの糸繊維をスピンするための効率的なの戦略を、について説明します。
Abstract
社会が進行するとリソースがscarcerになるにつれ、それは、高性能特性を持つエンジニアの次世代バイオマテリアル、新しい技術を開拓するためにますます重要になっています。これらの新しい構造材料の開発は、コスト効率の高い、迅速で、処理の方法論と環境に優しい持続可能な製品を含んでいる必要があります。スパイダーはライバル最高の人工と天然素材というバイオミミクリーのために次世代のエンジニアリング材料の豊富なソースを提供し、多様な機械的性質の異なる繊維の種類の多数のスピン。天然のクモの糸の大量のコレクションが現実的ではありませんので、合成絹の生産は、スレッドの無制限の供給へのアクセス権を持つ科学者を提供する能力を持っています。紡糸工程の合理化と完成することができますそのため、人工のクモの繊維がボディアーマーに至るまで幅広いアプリケーションに、縫合糸のための潜在的な用途を持っているS、綱及びケーブル、タイヤ、楽器用文字列、および航空宇宙技術の複合体。合成絹の生産工程を進めるために、スピン、スピンからその材料の特性で、低分散を表示する繊維を得るために、我々は、細菌、精製やタンパク質の濃度の組換えクモの糸タンパク質の発現を統合し、湿式紡糸プロトコルを開発しました、繊維の押出及び機械的なポスト·スピン治療が続く。これは、実験室規模での人工絹の繊維をスピンし、分析するステップ·バイ·ステップのプロセスを明らかにする最初の視覚的に表現したものです。また、同じ紡糸をつむいだ糸繊維間のばらつきの発生を最小限に抑えるため、詳細情報を提供します。総称して、これらの方法は、天然のクモの糸を凌駕する高品質の繊維につながって、人工絹の生産のプロセスを推進します。
Introduction
クモの糸が出高張力鋼、ケブラーとナイロンを含むいくつかの人工材料を、実行する特別な機械的特性を持っています。1スパイダーは、多様な機械的特性を表示し、少なくとも6月7日の異なる繊維の種類、引張強さと拡張性の様々な量で設計をそれぞれスピン特定の生物学的なタスクを実行することができます。2研究の科学者が急速にために共食いの3,4。ので、その優れた機械的性質、それらの生体適合性、およびそれらの非毒性と緑の材料の性質の次世代バイオマテリアルとしてのクモの糸を使用して追求され、農業を通してクモの糸を収穫クモの毒の性質は、工業規模の製造のために必要な需要を満たすための実践的な戦略ではありません。したがって、科学者たちは、から合成繊維の紡糸をin vitroで組み合わせるトランスジェニック生物における組換え絹タンパク質の生産になっているSE精製したタンパク質。フルレングスの組換えクモの糸タンパク質の5-8表現が彼らの非常に反復的な性質と物理的な長さ（> 15キロバイト）、GC-リッチコンテンツとバイアスを含むそれらの遺伝子配列の固有の性質与えられた技術的に困難であったアラニンとグリシンのコドン使用。現在までに9-11、ほとんどのラボは、部分的なcDNA配列または合成遺伝子を用いて主要なampullate糸タンパク質MaSp1またはMaSp2の切り捨てられた形を表現に焦点を当てている。12月15日スピニング合成クモの絹が必要とする困難なプロセスです。いくつかの科学分野、および紡糸プロセスの複雑さの習得と知識が完全に映像表現で一般大衆に明らかにされていない。実際には、世界中のラボのほんの一握りでは、クモの糸のcDNAを発現する絹タンパク質を精製、合成繊維を回転させ、ポストスピンドローを実行するための専門知識を持っているし、最後にそれらの生体材料の特性をテストします。 図8に示すように、紡績の合成繊維の16,17異なるアプローチは、湿式と乾式紡糸などエレクトロの方法を包含している16,18,19すべての手順は、一般的な1つの目標がある-機械的性質と合成クモの糸を生成するプロトコルの開発をそのライバル、自然のスレッド大規模な商業的な製造プロセスのために。
ここでは、湿式紡糸方法を用いて実験室規模で人工的なクモの糸を生成する手順を説明します。他の紡績方法と比較して、湿式紡糸は、繊維分析のための最も一貫した結果を生み出しています。私たちは彼らの精製に続いて細菌における組換え絹タンパク質の発現と、この手順の開始を概説し、その後でスレッドを生成する "などの紡糸"繊維に適用後のスピンドローの方法論を含めて、紡績のためのタンパク質の準備手順について説明します。天然のクモの糸の品質に近づく材料特性。私たちのmethodologyは密接に絹繊維の自然な紡糸プロセスを模倣し、それがオーブとCOB-織りスパイダーから絹生産腺のアーキテクチャおよび機能の専門知識に大きく描画するよう設計されています20から22はまた、我々が必要と結論研究者は究極の強さ、究極の歪み、繊維の靭性を計算できるように応力 – ひずみ曲線をプロットする張力計を用いた合成繊維の材料特性を決定するための手順を実行します。最後に、しかし重要な価値が、紡績スプール、および描画装置は、かなり手の込んだ、高価なカスタマイズされた機器を購入するより、市販の部品を使用して、自宅に構築することができます。
Protocol
Discussion
この方法論をつむいだ糸合成繊維は天然繊維に比べて機械的に同じ大きさのオーダーである。スプーリングとポストスピンドロープロセスを機械化によるヒューマンエラーの量を減少させることによって、サンプル間の実験的な変動は、より制御されており、大幅に減少しました。
私たちの方法論は、クモの遺伝子ファミリーの他のメンバーのcDNAからエンコードされた?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、それぞれ "ブラックウィドウスパイダーシルクとスパイダー接着剤シルクの力学的挙動の分子特性"と題されたNSF RUI助成MCB-0950372およびDMR-1105310によってサポートされていました。
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
Referências
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Bioquímica. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
