Para purificar de zigotos S. cerevisiae, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior "-mico" estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.
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Artigo de método
Purificação Citometria de Fluxo com base em
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Resumo
Resumo
Zigotos são intermediários essenciais entre haplóides e diplóides estados do ciclo de vida de muitos organismos, incluindo levedura (Figura 1) 1. S. cerevisiae zigotos resultado a partir da fusão de células haplóides de tipo de acasalamento diferente (MATa, MATalpha) e dar origem aos correspondentes diplóides estáveis que geram sucessivamente até 20 descendentes diplóides, como resultado das suas divisões mitóticas notavelmente assimétricas 2. Formação do zigoto é orquestrado por uma sequência complexa de eventos: Neste processo, os factores de acasalamento solúveis se ligam a receptores de cognato, desencadeando mediados por receptores cascatas de sinalização que facilitam a interrupção do ciclo celular e culmina na fusão célula-célula. Zigotos podem ser considerados um modelo para progenitor ou a função das células estaminais.
Embora muito se aprendeu sobre a formação de zigotos e, apesar de zigotos foram utilizados para investigar células-moleculares questões de interesse geral significance, quase todos os estudos fizeram uso de misturas de acasalamento em que os zigotos estão misturadas com uma população de maioria de células haplóides 3-8. Muitos aspectos da bioquímica da formação do zigoto ea vida continua do zigoto, portanto, permanecem sem investigação.
Relatos de purificação de zigotos levedura descrevem protocolos baseados nas suas propriedades de sedimentação 9, no entanto, este procedimento de sedimentação baseada não produziram cerca de 90% de pureza em nossas mãos. Além disso, ele tem a desvantagem de que as células são expostas ao sorbitol hipertónica. Por conseguinte, desenvolveram um processo de purificação versátil. Para este propósito, os pares de células haplóides que expressam proteínas de vermelho ou verde fluorescentes foram co-incubadas para permitir a formação do zigoto, colhidas a vários tempos e os zigotos resultantes foram purificadas utilizando um protocolo de triagem de citometria de fluxo com base. Esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente de pureza e de maturação. A pureza médiada fracção é de cerca de 90%. De acordo com o tempo de colheita, os zigotos de diferentes graus de maturidade podem ser recuperados. As amostras purificadas fornecer um conveniente ponto de partida para "-OMIC" estudos, para a recuperação da progênie inicial, e para a investigação sistemática desta célula progenitora.
Protocolo
1. Crescimento Celular haplóide
- Crescer S. células de Saccharomyces do fundo S288C (BY4741) sob condições padrão 10.
- Transformar haplóides para expressar qualquer uma das duas notáveis marcadores fluorescentes 10. Os marcadores de escolha são GFP solúvel expressa no citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado com BglII 11) e uma única proteína ribossomal, RPL25, fundido com mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, a partir de A. Johnston). Prevemos que os protocolos equivalentes de duas cores de purificação pode fazer uso de outras proteínas fluorescentes brilhantes que são sintetizadas pelas células haplóide....
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Discussão
A disponibilidade de zigotos purificadas deve facilitar estudos bioquímicos incluindo transcriptômica, proteômica e lipidómica, bem como de investigação de mecanismos pelos quais se submetem zigotos ciclo celular re-entrada, remodelamento da parede celular, características de brotamento e de herança, etc Alternativamente, os zigotos podem ser gerados a partir com estirpes de portadores de mutações características em um ou ambos os pais. Além disso, os zigotos purificados, assim como para células haplóides ou diplóides, .......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Michael R. Sramkoski ajuda com citometria de fluxo, Purnima Dr. Jaiswal e Di Dr. Wu para início de entrada e Aylyarov Ilya ajuda com as ilustrações. Suportado pelo NIH Grant R01GM089872 e Citometria & Imaging Core Facility Microscopia do Caso Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente / Equipamento | Fonte | Número de Catálogo | |
| pEG220, URA3/YIp, codificando GFP citoplasmática 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, codificação RPL25 fundido a mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher sonicador FB120 | Fisher Scientific | ||
| Tubo de polipropileno com filtro tampa | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Microcentrífuga refrigerada | Tomy | MRX-150 | |
| Fluxo da solução bainha citometria | Biosure | 1027 | |
| Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo | Sony | ||
| DeltaVision microscópio deconvolução | P aplicadorecision | ||
| Microscópio de epifluorescência ereta | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| Formulação de glucose CSM Notas: Para placas de agar, simplesmente incluir 2% de agar (Difco) | 10 |
Referências
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
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Reimpressões e permissões
