Tilrettelegging Drug Discovery: En automatisert høyt innhold Betennelse Assay i sebrafisk

Summary

Her beskriver vi en roman høyt innhold kjemisk indusert inflammasjon analysen sikte på identifisering av immun-regulerende bioactives. Vi har klart å kombinere automatisert mikroskopi med tilpassede utviklet programvare skript som gjør det mulig automatisert kvantifisering av betennelsesreaksjon, samt videre databearbeiding, analyse, gruvedrift, og lagring.

Abstract

Sebrafisk larver er spesielt mottagelig for hele dyret lite molekyl skjermer ^1,2 grunn av sin lille størrelse og relativ enkel manipulasjon og observasjon, samt det faktum at stoffene kan bare legges til badevann og opptas når det gis i en <1% DMSO løsning. På grunn av den optiske klarhet i sebrafisk larver og tilgjengeligheten av transgene linjer uttrykker fluorescerende proteiner i leukocytter, sebrafisk tilby den unike fordelen av å overvåke en akutt betennelsesreaksjon i vivo. Følgelig har utnyttelse av sebrafisk for høyt innhold små molekyl skjermer som tar sikte på identifisering av immun-regulerende forbindelser med høy gjennomstrømning blitt foreslått ^3-6, noe som tyder på betennelse induksjon scenarier f.eks lokaliserte hakk i fin vev, laser skade rettet mot eggeplomme overflaten av embryoer ⁷ eller tailfin amputasjon ^3,5,6. Den store ulempen av disse metodene ble imidlertidkravet om manuell larve manipulasjon å indusere såret, og dermed hindre high-throughput screening. Innføring av kjemisk indusert inflammasjon (Chin) assay ⁸ eliminert disse hindrene. Siden såret er påført kjemisk antall embryo som kan behandles samtidig er tilnærmet ubegrenset. Midlertidig behandling av sebrafisk larver med kobber sulfat induserer selektivt celledød i hårcellene i sidelinje systemet og resulterer i rask granulocytt rekruttering til skadde neuromasts. Inflammatorisk respons kan følges i sanntid ved hjelp av sammensatte transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ^6,9 sebrafisk larver som uttrykker en grønn fluorescerende protein i neuromast celler, samt et rødt fluoriserende protein merking granulocytter.

For å utarbeide en screening strategi som ville tillate både høy-innhold og high-throughput analyser vi introdusert robot væske håndtering og kombinerte automatisert microscopy med et egendefinert utviklet programvare skript. Dette skriptet gjør automatisert kvantifisering av inflammatorisk respons ved å score det prosent området okkupert av røde fluorescerende leukocytter innenfor en empirisk definert område rundt skadde grønne fluorescerende neuromasts. Videre vi automatisert databehandling, håndtering, visualisering og lagring alt basert på tilpasset utviklet MATLAB og Python-skript.

I korte trekk, innfører vi en automatisert HC / HT skjermen som gjør testing av kjemiske forbindelser for deres effekt på initiering, progresjon eller oppløsning av en granulocytisk inflammatorisk respons. Denne protokollen serverer et godt utgangspunkt for flere grundige analyser av narkotika mekanismer og stier involvert i orkestrering av en medfødte immunforsvaret. I fremtiden kan det hjelpe å identifisere utålelige giftige eller off-target effekter ved tidligere faser av medisiner og dermed redusere prosessuelle risiko og kostnader for legemiddelutvikling.

Protocol

1. Animal Håndtering For Chin analysen bruken 3 DPF larver som følge av konsernets parringer mellom homozygot dobbelt transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 og AB (villtype) fisk. Samle embryoer ved naturlig gyting og heve dem ved 29 ° C i E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, og 0,1% metylenblått, likevekt til pH 7,0) i petriskåler. Det er viktig å opprettholde en tetthet av embryoer ikke overstiger 50-70 per plate. 2. Larve Sortering Sjekk alle larver under en fluorescens stereoscope for fluoriserende reporter uttrykk, spontan betennelse og hensiktsmessig aldersrelatert utvikling. 3. Screening Medium Forberedelse (alltid forberede fersk) Forbered E3 medium uten metylenblått supplert med DMSO (1% final) og MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Forberedelse (alltid forberede fersk) Først veie ut CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) og forberede en 20 mM stamløsning i dH 2 O. Forbered 120 mM CuSO 4 arbeidsdager løsning (fra 20 mM stamløsning) i E3/DMSO (1%) / MS-222. Beskytt CuSO 4 løsning mot lys. 5. 384-brønnen Plate Forberedelse (Greiner 384 Well Mikroplate) Pre-add 20 mL av E3/DMSO (1%) / MS-222 til hver brønn med en omvendt pipette. En økt pipettespissen boring er nødvendig for å håndtere de embryoene forsiktig uten å påføre noen såret, dette gjøres ved å kutte spissen til en 2 mm bar. Overfør enkelt larve i 74 mL av middels til hver brønn (84 mL for ubehandlet kontroll). Om nødvendig, orientere larver i en lateral posisjon innenfor brønn med fleksibel Eppendorf Microloader pipettespissen (Eppendorf, 5242 956.003). Gjennomføre alle følgende væskehåndtering trinn med en robot væskehåndtering arbeidsstasjon for å sikre samtidig behandling av alle larver. 6. Medikamentell behandling Bland forbindelser i stoffet lager plate 5 ganger med pipettering opp og ned. Legg 16 mL av 7,5 x narkotika lager plate til hver brønn og bland 5 ganger. Juster tips posisjon innen brønner for å hindre skade av larver og dispensere mediet ved 10 mL / s. Bland medium i brønner 4 ganger for å sikre homogen fordeling av stoffet i brønnen. 7. Inkubasjon Inkuber screening plate i 1 time ved 29 ° C dekket med aluminiumsfolie for å beskytte forbindelser samt CuSO 4 fra lys. 8. Kjemisk såret Tilsett 10 mL av 120 mM CuSO 4 arbeider løsning til hver brønn unntatt til negative kontroller, mix 4 ganger og inkuber igjen i 1 time ved 29 ° C. 9. Vaske Fjern og utveksle 80 mL av meg DIUM fra hver brønn to ganger (i 20 mL trinn) for å fjerne forbindelser og CuSO 4. 10. Image Acquisition Begynn bilde oppkjøpet på en invertert automatisert mikroskop (dvs.: Olympus scan ^ R) 90 minutter etter første kobber behandling. Angi første z-nivå slik at neuromasts fra høyre og venstre bakre sidelinje er synlige. Bildet hver brønn gang per time i kanalene lysfelt, Cy3 og GFP i 4 kontaktpunkter fly (50 mikrometer avstand) med en 4x objektiv (NA = 0,13). Ytterligere informasjon om bildet og databehandling er tilgjengelig på forespørsel. 11. Bildebehandling 1. Datasortering Rå Bildene behandles med vår skikk LabView programvare skript. Den første operasjonen i bildebehandlingen rørledningen er sortering av rå bilder fra mikroskop generert data mappe ved kanalen, godt og tid-point informasjon. ove_step "> 2. Utvidet fokus Deretter programvare skaper utvidet fokus bildene fra 4 knutepunkter fly for hver av kanalene. 3. RGB-overlay I et siste trinn de utvidede fokus bildene fra de 3 kanalene er slått sammen til resultere i en endelig RGB-overlay bilde. 4. Automatisert neuromast deteksjon Et mønster gjenkjenning verktøy (LabView Rapid IA prototyping verktøy) identifiserer neuromasts innenfor RGB overleggsbilder og skaper en empirisk definert område av interesse rundt neuromasts. 5. Kvantifisering Innenfor empirisk definert område av interesse rundt skadde neuromasts røde lysstoffrør leukocytter (reflektert som røde punkter) blir scoret resulterer i en primær avlesning av p ercent en rimelig o ccupied ved l eukocytes (Paol). I 95.27 gjennomsnitt ± 2,11% (FDA1) og 95,12 ±1,56% (FDA2) av brønner (larver) har blitt oppdaget på riktig måte og er senere blitt utsatt for ytterligere databehandling. Rådata utgang (Paol for hver funnet neuromast) er lagret i en txt-fil og fungerer som inndata for MATLAB-skript som behandler rådataene videre. 12. Data Processing 1. IMAPS Vurdere suksessen av enkelte eksperimenter med grafisk visualisering av rådata utgang Paol i en fargekode kunne realiseres med såkalte betennelser kart (IMAPS) (figur 2). Bright green reflekterer en høy første inflammatorisk indeks; svart indikerer ingen betennelse. Dette rask oversikt muliggjør rask identifisering av mislykkede eksperimenter, som deretter kan utelukkes fra videre dataanalyser. 2. Gjennomsnitt av kontroller Hver eksperimentell plate inneholder 320 forbindelser som reflekterer enenkelt datapunkt per sammensatte og tids-punkt, samt 32 positive og negative kontroller, henholdsvis. Den 32 kontroll gjentak er gjennomsnitt og standardavvik beregnes. For kontrollene eneste datapunktene innenfor 2 standardavvik er inkludert. 3. Normalisering Normalisering gjøres ved regneark analyse. Den gjennomsnittlige verdien av DMSO, som er den negative kontrollen, er satt til 0 og det høyeste gjennomsnittet Paol for kobber kontrollen er satt til 1, slik at den maksimale forskjellen mellom positiv og negativ kontroll er satt til 1. Hver sammensatte Paol er lineært interpolert eller ekstrapolert til de respektive kontroller på eksperimentelle plate. 4. Endelig lese-out: Inflammatorisk index Etter tilstrekkelig replikatmålinger eksperimenter (dvs. 15) har blitt gjennomført, er normalisert rådata fra replikatmålinger eksperimenter i gjennomsnitt, noe som resulterer i en endelig lese-out – den inflammatoriskeindeks. Den første inflammatorisk indeks av kobber kontroll starter på 100% for tid-nullpunkt og samsvarer med bildet oppkjøpet start tid (90 minutter etter første kobber behandling). 5. Monoton eksponentiell regresjon montering På grunn av betennelse oppløsning over tid vi utfører en monoton eksponentiell lineær regresjon montering mot den opprinnelige betennelse ved hjelp – En 0 er et mål for den første respons ved t = 0, er en 1 relatert til skråningen av omfanget over tid. 6. 2-D egenskapsrom plott (figur 4) For å generere funksjonen plassen, er en ikke-lineær regresjon anvendt og en cluster-analyse deler funksjonen plass til karakteristiske regioner, og dermed gir automatisert identifikasjon av interessante kandidater fra ulike immun-regulerende kategoriene (anti-inflammatORY, anti-oppløsning, pro-inflammatorisk, pro-oppløsning). Alle forbindelser vises i 2-D plott basert på parametere en 0 og en 1. 13. Data Håndtering og oppbevaring Våre data håndtering rutiner lage websider for å visualisere og representere slike narkotika-skjermer som gir en rask oversikt over bildet og data foredlingsledd resultater, samt en detaljert visning når brukeren ber om 10. Myke lenker til andre relevante heterogene biologiske og kjemiske databaser er integrert, samt å gi en verdifull ressurs for komparative og romanen studier 11. Ved disse rutinene, er riktige data standarder og metainformation satt for langsiktig lagring av disse dataene. 14. Representative Resultater I en pilot skjerm analysert vi et bibliotek bestående av 640 FDA godkjente kjente bioaktive forbindelser for effekter på initiering, progresjon eller oppløsning av en granulocytic inflammatorisk respons. Basert på de observerte effektene vi klassifisert 4 typer immunmodulator fenotyper som kan tyde på ulike virkningsmekanismer: anti-inflammatorisk (1), anti-oppløsning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-oppløsning (4) , som kan beskrives med parametrene a 0 og 1, som oppstår fra en monoton ikke-lineær regresjon fitting (e ao ​​+ ALX -) mot den opprinnelige betennelse. Et 0 representerer omfanget av betennelsesreaksjon, mens en 1 karakteriserer helningen på kurven og dermed beskriver betennelse oppløsning. Viser alle forbindelser i en 2-D-funksjonen plass tomt (ett 1 vs en 0) åpner for automatisert identifikasjon av rammet kandidater fra de ulike immunmodulator kategorier (figur 3). 45 av 640 forbindelser som utøves betydelig anti-inflammatorisk effekt ved å redusere den initiale inflammatoriske indeksen til 50% eller mindre. Innen This kategori vi fant 6 forbindelser som tilhører den farmakologiske klasse av ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler (NSAIDs), som bekrefter gyldigheten av vår tilnærming. Men rangert NSAIDs ikke blant de mest potente anti-inflammatoriske legemidler. Bortsett fra de NSAIDs vi fant flere andre farmakologiske narkotika klasser som for eksempel Angiotensin reseptorblokkere (ARB), antibiotika og protonpumpehemmere. 7 forbindelser møtte empirisk definert terskel kriterier for potensielle pro-oppløsning narkotika. 18 rusmidler hatt en pro-inflammatorisk effekt, noe som resulterer i overdreven leukocytt rekruttering til skadde neuromasts forhold til de positive kontroller. Kun to forbindelser forhindret betimelig oppløsning av inflammatorisk respons. Den anti-inflammatorisk effekt av flere hit kandidater (eksemplariske kandidater fra ovennevnte farmakologiske narkotika klasser) fra piloten skjermen Could bli bekreftet i en doseavhengig måte i påfølgende sekundære Chin-analyser (data ikke vist). Retesting av 4 mulige pro-oppløsning narkotika ikke bekrefte den angitte virkningsmekanisme som utøves i den primære skjermen. 2 av narkotika hadde en svak anti-inflammatorisk potensial ved høyere konsentrasjoner (20 mm). En tredje medikament viste en marginal ikke-doseavhengig antiinflammatorisk effekt på stoff konsentrasjoner som spenner 5-20 mikrometer. Den fjerde stoffet hadde ingen effekt på inflammatorisk respons ved de konsentrasjonene som ble testet. Figur 1. Arbeidsflyt av haken analysen. Individuell sammensatte transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larver (3 DPF) er manuelt fordelt i 384-vel mikrotiterplater. Narkotika legges samtidig i hver brønn med en Zephyr Compact Væskehåndtering Workstation. Analysen platene er så inkuberes i 1 time ved 29 ° C. Behandling med CuSO 4 </sub> – Løsning (10 mM endelig konsentrasjon) for 1 t påfører den sårende og initierer en akutt betennelsesreaksjon. Endelig er kobber løsning og narkotika vasket av og automatisert bilde oppkjøpet er startet (90 minutter etter innledende kobber behandling). Figur 2. . Oversiktsbilde av RAW-bilder Figuren viser rå bilder av 4 kontaktpunkter fly (Z = 0 – 3) i en avstand på 50 mikrometer i kanalene Cy3 (til venstre) og GFP (til høyre), henholdsvis. Piler (Z = 1,2) indikerer eksemplariske neuromasts, pilspisser (Z = 1,2) peker klyngebaserte leukocytter rundt neuromasts. Figur 3. Betennelser Maps (IMAPS) Suksessen med enkelte eksperimenter kan vurderes i IMAPS reflekterer inflammatorisk respons (rådata) i en fargekode:. Bright green reflekterer en høy første infla mmatory respons; svart indikerer ingen betennelse IMAPS ved endepunktet 0 (venstre) og time-punkt 5 (høyre) viser tydelig om et eksperiment som bør inngå i videre databehandling.. Kobber kontroller (rad 13 og 24) dukker opp i varierende nyanser av grønt, mens DMSO kontroll brønner (rad 1 og 12) vises i mørk grønn eller svart. På time-punkt 5, er betennelse nesten løst i kobber kontroller, nå indikert i mørke nyanser av grønn eller svart. Klikk her for å se større figur . Figur 4. 2-D-funksjonen plass tomt på 320 forbindelser av en FDA godkjent bibliotek og deres respektive kontroller. Alle sammensatte brønner kan vises i en 2-D-funksjonen plass plott basert på parametere en 0 og en 1, som oppstår fra et ikke-lineær regresjon montering (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Formel 1 "/>) mot den opprinnelige betennelse. Denne funksjonen plass tomten tillater automatisert identifikasjon av interessante kandidater som tilhører en av følgende 4 immun-regulerende kategorier som kan tyde på narkotika 'modusen for handling:. anti-inflammatorisk (1), anti-oppløsning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-oppløsning (4) Klikk her for å se større figur .

Discussion

<p class="jove_content"> Her presenterer vi en helautomatisk high-throughput screening strategi muliggjør identifisering av immun-regulerende stoffer i en hel dyr sammenheng. Dermed tillater overvåking av en akutt betennelsesreaksjon<em> In vivo</em> Og i sanntid.</p><p class="jove_content"> Vi gir en protokoll for å søke sebrafisk som en verdifull modell organisme for medisiner eller narkotika gjenbruk innsats, ettersom stoffet effekter på leukocytt rekrutteringen til sår kan bli studert med relativ letthet i sammenheng med en fullt funksjonell medfødte immunforsvaret. Den unike fordelen av vår tilnærming er at kjemisk såret gjengir manuell larver manipulasjon foreldet, og dermed tillater automatisering og screening i en high-throughput format.</p><p class="jove_content"> I tillegg kan uønskede eller toksiske virkninger av rusmidler samt sterk off-target effekter enkelt vurderes med den foreslåtte oppsettet. FDA godkjente Biblioteket imidlertid ikke inneholde noen giftige forbindelser ved den gitte screening konsentrasjoner. Likevel foreslår vi for tilsynelatende giftige forbindelser for å sammenligne den tilgjengelige datasettet (f.eks immunmodulator fenotype, narkotika konsentrasjon) mellom medlemmer av samme farmakologiske stoffet klasse stede i testet biblioteket. Giftig medlemmer av et stoff familie, som ellers utøver en lovende immunmodulator fenotype, kan den prøves ved lavere konsentrasjoner, hvis behovet være.</p><p class="jove_content"> Vi har demonstrert muligheten for å kategorisere narkotika automatisk i henhold til deres utøvde immun-regulerende effekt. Legemidler som hører til kategorien av anti-inflammatoriske stoffer kan valideres i uavhengige eksperimenter, de fleste av forbindelsene øve sin virkning i en doseavhengig måte. Fire forbindelser identifisert som potensielle pro-oppløsning narkotika kan så langt ikke bekreftes som sådan. Det indikerer også at dette immunmodulator kategori er vanskelig å beskrive, siden ingen medikamenter utelukkende påvirker oppløsning, har så langt blitt beskrevet i litteraturen. Imidlertid viste 3 av de 4 retested narkotika en anti-inflammatorisk trend ved høyere molar konsentrasjon. Optimalisere de empirisk definerte terskelen kriterier bør bidra til å redusere antallet falske-positive.</p><p class="jove_content"> Videre tilbyr presenterte teknikken muligheten skal benyttes for identifikasjon av mutasjoner i gener som påvirker leukocytter trekkadferden⁸.</p><p class="jove_content"> Avsluttende, den foreslåtte metoden kan lette og akselerere medisiner eller narkotika gjenbruk innsats ved å gi etter potensielle nye bly strukturer med lett tilgjengelig informasjon om narkotika toleranse, giftighet, dosering samt potensielle off-target effekter. Derfor fungerer som en enkel, kostnadseffektiv og tidsbesparende strategi på tidlige stadier av narkotika utvikling.</p>

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Dimethyl sulphoxide	Carl Roth GmbH & Co KG	A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous	Carl Roth GmbH & Co KG	PO23.1
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear	Greiner	781906	black
Olympus scan^R	Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation	Caliper