Содействие Drug Discovery: Автоматизированные высокого содержания воспаление Анализ в данио рерио
Summary
Здесь мы опишем новый высоким содержанием химически индуцированных воспаление анализ, направленный на определение иммунного-модулирующее биоактивных. Мы удачно сочетаются автоматизированной микроскопии с пользовательскими скриптами разработанное программное обеспечение позволяет автоматизированной количественной оценки воспалительных реакций, а также дальнейшей обработки и анализа данных, добычи и хранения.
Abstract
Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a <1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.
Protocol
1. Обработка животных Для использования Чин анализа 3 DPF личинок, вытекающие из группы вязки между гомозиготных трансгенных двойной cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 и AB (дикого типа) рыбы. Сбор эмбрионов естественного нереста и поднять их на 29 ° C в E3 среды (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4 и 0,1% метиленовым синим, сравняться с рН 7,0) в чашках Петри. Это необходимо для поддержания плотности эмбрионов не более 50-70 на чашку. 2. Личинка Сортировка Проверьте все личинки под флуоресцентным стереоскоп для люминесцентных выражение репортера, самовозгорания и соответствующие возрастные развития. 3. Отбор средней подготовки (всегда готовить свежими) Подготовить E3 среде без метиленовый синий дополнить ДМСО (1% финал) и MS222 (0,05 г / л). 4. CuSO4Подготовка (всегда готовить свежими) Первый отвешивать CuSO 4 (M г = 159,6 г / моль) и подготовить 20 мМ маточного раствора в дН 2 O. Подготовить 120 мкм CuSO 4 Рабочий раствор (от 20 маточного раствора ммоль) в E3/DMSO (1%) / MS-222. Защита CuSO 4 решения от света месте. 5. 384-а пластина подготовка (Greiner 384 лунками) Предварительно добавить 20 мкл E3/DMSO (1%) / MS-222 в каждую лунку с обратным пипетки. Повышение пипетки отверстия требуется для обработки эмбрионов осторожно, не причиняя любого ранения, это будет сделано за счет сокращения наконечник 2 мм отверстие. Передача одной личинки в 74 мкл среды в каждую лунку (84 мкл для необработанного контроля). В случае необходимости, ориентировать личинок в боковом положении внутри скважины с использованием гибкой Эппендорф Microloader пипетки (Eppendorf, 5242 956,003). Провести все последующие шаги обработки жидкой с роботом жидкихобработка рабочих станций для обеспечения одновременное лечение всех личинок. 6. Лечению от наркотической зависимости Смешайте соединений наркотиков пластины акции в 5 раз с помощью пипетки вверх и вниз. Добавить 16 мкл 7.5x пластины акции препарата в каждую лунку и перемешать в 5 раз. Отрегулируйте положение наконечника в скважины для предотвращения травм личинок и обойтись среды в 10 мкл / с. Смешайте среды в лунки 4 раза для обеспечения равномерного распределения препарата в колодец. 7. Инкубация Инкубируйте скрининг пластины течение 1 часа при 29 ° C покрыта алюминиевой фольгой для защиты соединений, а также CuSO 4 от света месте. 8. Химическая Ранение Добавить 10 мкл 120 мкМ CuSO 4 рабочего раствора в каждую лунку, кроме отрицательного контроля, смесь 4 раза и инкубировать еще 1 ч при 29 ° C. 9. Мытье Удалите и обмен 80 мкл меня средой из каждой лунки дважды (в 20 мкл шагов) для удаления соединений и CuSO 4. 10. Image Acquisition Начать получения изображения на перевернутую автоматизированного микроскопа (а именно: Olympus сканирования ^ R) через 90 минут после начала лечения медью. Установить начальную Z-уровня, так что невромастов из правой и левой задней боковой линии видны. Изображение каждой скважины раз в час в светлое каналов, Cy3 и GFP в 4 основные плоскости (расстояние 50 мкм), используя 4x цель (NA = 0,13). Дополнительная информация о обработка изображений и данных предоставляются по запросу. 11. Обработка изображений 1. Сортировка данных Сырье изображения обрабатываются с нашей специальный скрипт программного обеспечения LabView. Первая операция в стадии обработки изображений сортировки сырых изображений с микроскопа получены данные папки канал, ну и раз-информационный пункт. ove_step "> 2. Расширенный фокус Затем программа создает расширен фокус изображения с 4 фокальных плоскостей для каждого из каналов. 3. RGB-оверлей В последнем шаге расширенного изображения фокус с 3 канала будут объединены, чтобы привести к окончательной RGB-наложения изображений. 4. Автоматическое определение neuromast Инструмент распознавания (LabView быстрого прототипирования И.А. инструмент) определяет невромастов в изображения RGB наложения и создает эмпирически определить сферу интересов вокруг невромастов. 5. Квантификация В эмпирически определить сферу интересов окружающих потерпевшей невромастами красный флуоресцентный лейкоцитов (отражается как красные точки) оцениваются в результате первичного считывания с ercent REA о ccupied по eukocytes л (Paol). В среднем 95,27 ± 2,11% (FDA1) и 95,12 ±1,56% (FDA2) скважин (личинки) были обнаружены правильно и впоследствии подвергаются дальнейшей обработке данных. Сырье выходных данных (Paol для каждого обнаруженного neuromast) хранится в текстовом файле и выступает в качестве входных данных для скриптов MATLAB, что обработка исходных данных в дальнейшем. 12. Обработка данных 1. IMAPS Оценивая успехи отдельных экспериментов по графической визуализации сырья выходных данных Paol в цветовой код может быть реализована с так называемой воспалением карт (IMAPS) (рис. 2). Ярко-зеленый отражает высокий первоначальный воспалительный индекс, черный указывает на отсутствие воспаления. Этот краткий обзор позволяет быстро идентифицировать неудачных экспериментов, которые затем могут быть исключены из дальнейшего анализа данных. 2. Усреднение управления Каждая экспериментальная пластинка содержит 320 соединений отражающиходним данные указывают на соединение и временной точке, а также 32 положительных и отрицательных контролей, соответственно. 32 контроль репликации являются усредненными и стандартное отклонение рассчитывается. Для контроля только точки данных в течение 2 стандартных отклонения включены. 3. Нормализация Нормализация осуществляется путем анализа таблиц. Среднее значение ДМСО, будучи отрицательным контролем, имеет значение 0, а самый высокий усредненный Paol для меди контроль установлен в 1, так что максимальная разница между положительными и отрицательными управления устанавливается в 1. Paol Каждое соединение является линейной интерполяции или экстраполяции соответствующих органов управления по экспериментальной пластине. 4. Окончательный считывания: Воспалительные индекс После достаточного экспериментов репликации (например, 15) были проведены, нормированная необработанные данные от повторных опытов среднем, в результате чего окончательный считывания – воспалительныеиндекс. Первоначально воспалительный индекс меди контроль начинается с 100% времени нуля и коррелирует Для получения изображения времени начала (через 90 минут после начала лечения медь). 5. Монотонные экспоненциальной подгонки регрессии Из-за воспаления разрешение в течение долгого времени мы проводим монотонный экспоненциальный нелинейный монтаж регрессии к начальной воспаления с помощью – 0 мера для первоначальной реакции при Т = 0, 1, связанных с наклоном величины с течением времени. 6. 2-D пространстве признаков участок (рис. 4) Чтобы создать пространство признаков, нелинейной регрессии применяется и кластер-анализ делит пространство признаков в характерных областей, что позволяет автоматической идентификации интересных кандидатов из различных иммунных модулирующее категории (анти-inflammatТеория, анти-разрешение, провоспалительных, про-разрешение). Все соединения отображаются в 2-D участка в зависимости от параметров 0 и 1. 13. Обработки данных и хранения Наши данные процедуры обработки создать веб-страницы для визуализации и представлять такие экраны наркотиков обеспечивая быстрый обзор изображений и обработки данных шагов "результаты, а также подробный обзор по требованию пользователя 10. Мягкие ссылки на другие соответствующие гетерогенных биологических и химических баз данных, а также интегрированные предоставить ценный ресурс для сравнительного исследования и роман 11. С помощью этих процедур, надлежащих стандартов данных и метаинформации устанавливаются на длительный срок хранения этих данных. 14. Представитель Результаты В экспериментальном экране мы проанализировали библиотеку, состоящую из 640 FDA одобрило известных биологически активных соединений для воздействия на инициации, прогрессии или разрешение Гранулocytic воспалительной реакции. На основании наблюдаемых эффектов мы классифицировали 4 типа иммунных фенотипов модулирующее, что может свидетельствовать о различных режимах действие: противовоспалительное (1), анти-разрешением (2), провоспалительных (3) и про-разрешением (4) , который может быть описан с параметрами 0 и 1, которые вытекают из монотонной нелинейной регрессии установки (е ао + ALX -) по отношению к начальной воспаления. 0 обозначает величину воспалительной реакции в то время как 1 характеризует наклон кривой и, следовательно, описывает воспаление разрешения. Отображение всех соединений в 2-D пространстве признаков участка (1 против 0) позволяет автоматической идентификации удар кандидатов из разных категорий иммунной модулирующее (рис. 3). 45 из 640 соединений оказывает значительное противовоспалительное действие за счет снижения начальной воспалительного индекса на 50% или меньше. В Тхис категорией мы нашли 6 соединений, принадлежащих к фармакологического класса нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), подтверждающие обоснованность нашего подхода. Однако НПВП не место среди самых мощных противовоспалительных препаратов. Наряду с НПВП мы нашли несколько дополнительных фармакологических классов препаратов, таких как, например блокаторы рецепторов ангиотензина (БРА), антибиотиков и ингибиторов протонной помпы. 7 соединений встретился с эмпирически определенными критериями порог для потенциальных про-разрешение наркотиков. 18 препаратов оказывает провоспалительных эффект, что приводит к преувеличенным лейкоцитов набор пострадавшим невромастами по сравнению с положительным контролем. Только 2 соединения помешали своевременному устранению воспалительной реакции. Противовоспалительное действие нескольких кандидатов хит (образцовый кандидатов от вышеуказанных фармакологических препаратов) с Коула экране пилотг быть подтверждены в зависимости от дозы, в последующих вторичных анализов подбородка (данные не представлены). Повторное 4 потенциальных про-разрешение наркотиков не подтвердило указанные образ действий, как оказываемся в основной экран. 2 наркотиков было небольшое противовоспалительное потенциал при более высоких концентрациях (20 мкм). Третий препарат выставлены маргинальной, не дозозависимое противовоспалительное действие при концентрации препарата в пределах от 5 – 20 мкм. Четвертый препарат не влияет на воспалительные реакции при концентрациях испытания. Рисунок 1. Workflow подбородка анализа. Индивидуальные соединения трансгенных cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 личинок (3 DPF) вручную распространяется в 384-луночных микротитровальных. Наркотики добавляются одновременно в каждую лунку помощью Zephyr Компактная рабочая станция обработки жидкости. Анализ пластины затем выдерживают в течение 1 часа при 29 ° C. Лечение CuSO 4 </sub> – Решение (10 мкм конечная концентрация) в течение 1 ч наносит ранения и инициирует острой воспалительной реакции. Наконец, решение меди и препаратов смывается и автоматизированного получения изображений запущен (через 90 минут после начала лечения медь). Рисунок 2. . Обзор картину необработанных изображений рисунке необработанные изображения 4 фокальных плоскостях (Z = 0 – 3) на расстоянии 50 мкм в каналах Cy3 (слева) и GFP (справа), соответственно. Стрелки (Z = 1,2) указывают на образцовое невромастов, наконечники стрел (Z = 1,2) указывают на кластерных лейкоцитов вокруг невромастов. Рисунок 3. Воспаление Maps (IMAPS) Успех отдельных экспериментов может быть оценен в IMAPS отражающие воспалительную реакцию (исходные данные) в цветовой код. Ярко-зеленый отражает высокую начальную инфляции mmatory ответ, черный указывает на отсутствие воспаления IMAPS на timepoint 0 (слева) и временной точке 5 (справа) наглядно показывают, является ли эксперимент должны быть включены в дальнейшую обработку данных.. Медные управления (строка 13 и 24) показывают, в различные оттенки зеленого, в то время как ДМСО контроль скважин (строка 1 и 12) появится в темно-зеленый или черный. В момент, пункт 5, воспаление практически решен в меди управления, в настоящее время, указанные в темные оттенки зеленого или черного цвета. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 4. 2-D пространстве признаков участок 320 соединений FDA одобрило библиотеки и их контроля. Все соединения скважин может быть отображена в 2-D участок пространства функций на основе параметров 0 и 1, которые вытекают из нелинейного регрессии фитинга (d/4203/4203eq1.jpg "ALT =" Формула 1 "/>) к начальной воспаления. Этот участок пространства признаков позволяет автоматизировать выявление интересных кандидатов, принадлежащих к одной из следующих 4 иммунной модулирующее категорий, которые могут указывать на наркотики «способ действия. противовоспалительные (1), анти-разрешением (2), провоспалительных (3) и про-разрешением (4) Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Discussion
<p class="jove_content"> Здесь мы приводим полностью автоматизирован высокопроизводительного скрининга стратегии, позволяющие идентифицировать иммунной модулирующее соединений в целом контексте животных. Таким образом, позволяя контролировать острая воспалительная реакция<em> В естественных условиях</em> И в режиме реального времени.</p><p class="jove_content"> Мы предоставляем протокол применять данио как ценный модель организма для обнаружения наркотиков или перепрофилирования усилия, так как препарат воздействия на лейкоциты набор на раны могут быть изучены с относительной легкостью в рамках полнофункциональной системе врожденного иммунитета. Уникальным преимуществом нашего подхода является то, что химический ранения оказывает ручного манипулирования личинок устарели, что позволяет автоматизации и проверки в высокой пропускной способности формате.</p><p class="jove_content"> Кроме того, неблагоприятные или токсических эффектов препаратов, а также сильные пределы целевой эффекты могут быть легко оценить с предлагаемой установки. Библиотека FDA утвержденных, однако, не содержит токсичных веществ на данной концентрации скрининга. Тем не менее, мы предлагаем очевидно токсичных соединений для сравнения имеющихся данных (например, иммунной фенотип модулирующее, концентрация препарата) между членами одной фармакологической настоящий класс веществ в тестируемой библиотеки. Токсичные членов семьи вещества, которые в противном случае оказывает перспективный иммунный фенотип модулирующее, может быть повторно при более низких концентрациях, в случае необходимости.</p><p class="jove_content"> Мы продемонстрировали возможность классификации наркотиков автоматически в зависимости от их оказывается иммунной модулирующее действие. Средств, относящихся к категории противовоспалительные соединения могут быть проверены в независимых экспериментах, в большинстве соединений оказывают свое действие в зависимости от дозы. Четыре соединения определены как потенциальные про-разрешение препараты могут до сих пор не может быть подтверждена как таковой. Он также указывает, что данная категория иммунной модулирующее трудно описать, так как никаких наркотиков, влияющих только разрешение до сих пор были описаны в литературе. Тем не менее, 3 из 4 препаратов повторное тестирование показало, противовоспалительное тенденция на более высоких молярных концентрациях. Оптимизация эмпирически определенные критерии порога должно помочь уменьшить количество ложных срабатываний.</p><p class="jove_content"> Кроме того, представлена методика дает возможность быть использована для идентификации мутаций в генах, влияющих лейкоцитов миграционное поведение<sup> 8</sup>.</p><p class="jove_content"> В заключение предложенного метода можно облегчить и ускорить открытие наркотиков или перепрофилирования усилий приносит потенциальных новых структур свинца с доступной информацией о наркотиках терпимости, токсичность, дозы, а также потенциальные пределы целевого эффекта. Таким образом, выступающей в качестве простого, экономически и экономии времени стратегия на ранних этапах разработки лекарственных препаратов.</p>
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Мы благодарим Надежда Волк, Надин Eschen и Сюзанна Делонг за отличную животноводства. CW был поддержан кандидат общение с программой Гельмгольца<em> BioInterfaces</em> Международных аспирантура (BIFIGS). Дополнительная поддержка была оказана КИТ-RISC грантов и Marie Curie International реинтеграции Грант в 7-й Европейского Сообщества Рамочной программы (PIRG07-GA-2010-267552) в CG. AHS была поддержана жирным шрифтом (биология печени и поджелудочной железы и развитие болезни) – Мари Кюри Сеть по обучению (238 821). UL был поддержан Dopaminet FP7 (Седьмая рамочная программа) (223 744).</p>
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH & Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
Referências
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
- Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
- Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- D’Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
- Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
- Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet’ – towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
- Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester’: a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).
Citar este artigo
Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).