تنقية وتجميع على البروتين اميلويد السلائف المجال بين الخلايا
Summary
ووصف طريقة لتنقية واسعة النطاق للمجال APP داخل الخلايا (AICD). وصفنا أيضا منهجية للحث<em> في المختبر</em> AICD التجميع والتصور بواسطة المجهر القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف البيوكيميائية / الهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع لها.
Abstract
اميلويد السلائف البروتين (APP) هو نوع من البروتين عبر الغشاء I المرتبطة التسبب في مرض الزهايمر (AD). ويتميز APP بواسطة ملك خارج الخلية الكبيرة ومجال عصاري خلوي يسمى قصيرة المجال APP داخل الخلايا (AICD). خلال النضج من خلال مسار إفرازية، يمكن المشقوق APP بواسطة البروتياز وصف α، β، γ-secretases و1. انشقاق بروتين متسلسلة من APP مع β γ وsecretases-يؤدي إلى إنتاج بروتين الببتيد الصغيرة، ووصف Aβ، وهو amyloidogenic والمكونة الأساسية لويحات خرف. وAICD أيضا تتحرر من الغشاء بعد تجهيز secretase، ومن خلال التفاعل مع Fe65 وTip60، يمكن نقل من لنواة للمشاركة في تنظيم النسخ من الجينات المستهدفة متعددة 2،3. قد البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على الاتجار تؤثر AICD، وتجهيز، والوظائف الخلوية من هولو-APP والخمسين C-ترمنشظايا آل. لقد أظهرنا مؤخرا التي يمكن الإجمالية في المختبر، وهذه العملية يتم من قبل AICD تحول دون ubiquilin-1 AD-المتورطين كوصي الجزيئية 4. بما يتفق مع هذه النتائج، AICD كشفت المجالات مسعور والمختلين جوهريا في المختبر 5،6، ومع ذلك فإنه يحصل هيكل مستقر الثانوية عندما يتجهون إلى Fe65 7. وقد اقترحنا أن ubiquilin-1 يمنع غير لائق التفاعلات بين وداخل الجزيء من AICD، ومنع تجميع في المختبر وخلايا سليمة في 4. في حين أن معظم الدراسات تركز على دور APP في التسبب في AD، ودور AICD في هذه العملية ليست واضحة. وقد تبين من التعبير للحث على موت الخلايا المبرمج AICD 8، لتعديل مسارات إشارات 9، وتنظيم الكالسيوم مما يشير 10. الإفراط في التعبير عن AICD وFe65 في نموذج الفأر المعدلة وراثيا يؤدي مثل علم الأمراض مرض الزهايمر 11، ومؤخرا تم الكشف عن AICD في البرازيللست] في غرب النشاف من قبل عند استخدام التقنيات المناسبة استرجاع مستضد 12. لتسهيل الدراسات الهيكلية، والكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية وللAICD، وقد وضعنا الداخلي لإنتاج كميات كبيرة من البروتين recombinantly AICD نقية للغاية. وصفنا طريقة أخرى لإحداث التجميع في المختبر الحراري للAICD والتحليل المجهري القوة الذرية. الأساليب المذكورة مفيدة لتوصيف الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، والهيكلية للAICD وآثار المحرمين الجزيئية على تجميع AICD.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول وقد أوجزنا في إجراءات الحصول على AICD نقية للغاية لتحليل الهيكلية، الفيزياء الحيوية، والكيمياء الحيوية. هذا الإجراء لا يتطلب معدات متطورة اللوني، وبالتالي الوصول إلى معظم المختبرات. طهروا مجموعات أخرى AICD 5-7،16، بما في ذلك GST-AICD 17-19، لتحالي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشنغ هوى (كلية بايلور للطب) لAPP [كدنا]. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R21AG031948 (DB، JMB)، F30AG030878 (ESS)، R01DK073394 (AFO)، وسيلي جون صندوق الهبات التذكارية للبحوث الطبية الحيوية (AFO)، وجان وليم C. D. ويليس العلوم العصبية بحوث الوقف (ESS). JMB هو باحث في برنامج البحوث الباحث بالحركة وعضو في جامعة تكساس الطبية فرع كلود E. فلفل أقدم مركز الاستقلال الأميركيين (بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح UL1RR029876 وP30-AG-024832 على التوالي).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
Referências
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
