שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר ') ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.
חברים מסוימים של המשפחה פנימה מיישר אשלגן (קיר ') הערוץ הם הניחו מטרות תרופה למגוון של הפרעות, כולל יתר לחץ דם, פרפור פרוזדורים, ו1,2 כאב. ברוב המקרים, עם זאת, התקדמות לקראת הבנת הפוטנציאל הטיפולי שלהם או הפונקציות פיסיולוגיות בסיסיות אפילו הואטה על ידי המחסור בכלים פרמקולוגיים טובים. אכן, פרמקולוגיה המולקולרית של משפחת המיישר פנימה כבר פגרה הרחק מאחורי זו של superfamily S4 של אשלגן ערוצי מתח מגודר (KV), שעבורו מספר של זיקת nanomolar ומאפנני הרעלן פפטיד סלקטיבית מאוד התגלו 3. Tertiapin דבורת ארס הרעל ונגזרותיו הם מעכבי עצמה של Kir1.1 וKir3 ערוצים 4.5, אבל הפפטידים של שימוש המוגבל טיפולי, כמו גם בניסוי בשל מאפייני antigenic והזמינות הביולוגיות ירודה, יציבות מטבולית וחדירנות רקמות. הפיתוח של עצמהובדיקות, במולקולה קטנה סלקטיבית עם תכונות פרמקולוגיות משופרות תהיינה מפתח להבנת הפיסיולוגיה והפוטנציאל טיפולי של ערוצי קיר 'באופן מלא.
מולקולרי ספריות בדיקות הפקת מרכז הרשת (MLPCN) הנתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) קרן משותפת יצרה הזדמנויות למדענים אקדמיים ליזום קמפייני בדיקת גילוי מטרות מולקולריות ולמסלולי איתות בצורך לפרמקולוגיה הטובה יותר 6. MLPCN מספק חוקרי גישה למרכז הקרנת התעשייה בקנה מידה ובכימיה ואינפורמטיקה רפואית תומכות לפתח חלליות מולקולה קטנה שתסברנה את הפונקציה של גנים ורשתות גנים. השלב הקריטי בהשגת הכניסה לMLPCN הוא הפיתוח של היעד או מסלול הספציפי assay החזק שהוא נוח לתפוקה גבוהה הקרנה (HTS).
כאן, אנו מתארים כיצד לפתח פלואורסצנטי מבוסס תליום (Tl +) שטף אסאy של פונקצית קיר 'ערוץ להקרנת מתחם תפוקה גבוהה 7,8,9,10. assay מתבסס על החדירות של K + ערוץ הנקבובי לK + + Tl משלימתו. זמין מסחרי ניאון Tl + כתב צבע משמש לאיתור שטף הטרנסממברני של Tl + הדרך הנקבובית. ישנן לפחות שלושה צבעים זמינים מסחרי שמתאימים לTl + מבחני שטף: BTC, FluoZin-2, וFluxOR 7,8. פרוטוקול זה מתאר פיתוח assay באמצעות FluoZin-2. למרות שפותח במקור ושווק כמחוון אבץ, FluoZin-2 מוצגי גידול יציב ותלוי במינון בפליטת פלואורסצנטי על Tl + כריכה. התחלנו לעבוד עם FluoZin-2 לפני FluxOR היה זמין 7,8 וממשיך לעשות זאת 9,10. עם זאת, בשלבים בפיתוח assay הם למעשה זהים בכל השלושה הצבעים, והמשתמשים צריכים לקבוע איזה צבע מתאים ביותר עבור n הספציפי שלהםeeds. כמו כן, אנו דנים את מדדי ביצועים של assay שיש להגיע אליה כדי להיחשב לכניסה לMLPCN. מאז Tl + + בקלות מחלחל ערוצים רוב K, assay צריך להיות להתאמה מרבית היעדים + K הערוץ.
טיפול נתונים: לאחר שהנתונים נאסף, צעד נפוץ בניתוח כרוך בנרמול התגובה של כל גם פלואורסצנטי, F, לשווי הראשוני שלה בתחילת הניסוי, נ 0. זה נפוץ המכונה "יחס סטטי" וסמל "F / F 0". במקרים בי F 0 נשלטים על ידי צבע חיווי פעולת יחס סטטי משמעותי…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות מענקי 1R21NS073097-01 ו1R01DK082884 (JSD) וקרן למכוני המענק PIER11VCTR הלאומי.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.