Bildebehandling Kalsium Responses i GFP-merket Neurons av hypothalamus mus hjernen Slices

Summary

I denne protokollen, oppdaterer vi siste utviklingen i bildebehandling Ca^{2 +} Signalene GFP-merket nevroner i hjernen vev skiver med en rød fluorescerende Ca^{2 +} Indikator fargestoff.

Abstract

Til tross for en enorm økning i kunnskap om mekanismene bak koding av informasjon i hjernen, en sentral spørsmål om de nøyaktige molekylære trinn samt aktivitet av spesifikke nerveceller i multi-funksjonelle kjerner av hjernen områder som hypothalamus forbli. Dette problemet omfatter identifikasjon av de molekylære komponentene som er involvert i reguleringen av ulike neurohormone signaltransduksjon kaskader. Forhøyninger av intracellulært ^{Ca2 +} spille en viktig rolle i regulering av følsomheten av nevroner, både på nivået av signaltransduksjon og på synaptiske områder.

Nye verktøy har kommet for å hjelpe med å identifisere nevroner i mylderet av hjernen neurons ved å uttrykke grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av en bestemt promoter. Å overvåke både romlig og tidsmessig stimulus-indusert Ca ^{2 +} svar i GFP-merkede nevroner, en non-grønn fluorescerende Ca ^{2 +} indikator dye needs skal brukes. I tillegg er konfokalmikroskopi en favoritt fremgangsmåte for avbildning individuelle nevroner i vev skiver på grunn av sin evne til å visualisere nevroner i distinkte plan av dybde i vevet, og å begrense ut-av-fokus fluorescens. Den Proporsjonal Ca ^{2 +} indikator fura-2 har vært brukt i kombinasjon med GFP-merket nevroner ^1. Imidlertid er fargestoffet opphisset av ultrafiolett (UV) lys. Kostnaden av laseren og den begrensede optiske inntrengningsdybde av UV-lys hindret bruken i mange laboratorier. Videre kan GFP fluorescens forstyrre fura-2 signaler ^2. Derfor har vi besluttet å bruke en rød fluorescerende Ca ^{2 +} indikator fargestoff. Den enorme Strokes forskyvning av fura-rød tillater flerfarget analyse av rød fluorescens i kombinasjon med GFP hjelp av en enkelt eksitasjonsbølgelengde. Vi hadde tidligere gode resultater ved bruk av fura-rød i kombinasjon med GFP-merket olfactory neurons ^3. Protokollene for olfactory vev skiver syntes å fungere equally godt i hypothalamus nevroner ^4. Fura-red basert Ca ^{2 +} bildebehandling ble også vellykket kombinert med GFP-merket bukspyttkjertelen β-celler og GFP-merket reseptorer uttrykt i HEK celler ^5,6. Litt innfall av fura-rødt er at dens fluorescens intensitet ved 650 nm avtar når indikatorlampen binder kalsium ^7. Derfor har fluorescens av hvilende nevroner med lav ^{Ca2 +} konsentrasjon relativt høy intensitet. Det bør bemerkes at andre røde Ca ^{2 +-indikatoren} fargestoffer eksisterer eller er under utvikling, som kan gi bedre eller forbedret resultat i ulike nerveceller og hjernen områder.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsning og agarosegel Forbered ekstracellulære løsningen ifølge tabellen med dobbelt-destillert vann. PH vil være ~ 7,3 etter 10 min lufting med CARBOGEN (95% O 2/5% CO2), osmolariteten 300 8 mOsm. Hvis en høyere osmolaritet er nødvendig, kan den justeres ved å tilsette mer glukose (1 mM tilsvarer 1 mOsm). Oppløsningen filtreres to ganger ved hjelp av et 0,2 um membranfilter for å eliminere støvpartikler og mulige bakterielle forurensninger. <table…

Discussion

En viktig spørsmål i nevrovitenskap er å forstå hvordan hjernen behandler sosial informasjon. En dominerende kilden til informasjon som er nødvendig for sosial anerkjennelse er kodet av olfactory eller Pheromonal signaler. Påvisning av disse signalene ved nevronale populasjoner i nesen og anerkjennelse av signalene i hjernen, spesielt hypotalamus, spille en viktig rolle i mange sosiale prosesser og påvirke hormoner og andre neuroendokrine faktorer ^13-16. En vesentlig hindring for å analysere neuronal …

Materials

Name	Company	Cat. N°
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.