الردود الكالسيوم في الخلايا العصبية التصوير GFP الموسومة تحت المهاد البصري من شرائح مخ الفأر
Summary
في هذا البروتوكول، نقوم بتحديث التقدم الذي أحرز مؤخرا في كاليفورنيا التصوير<sup> 2 +</sup> الإشارات من الخلايا العصبية في GFP الموسومة شرائح أنسجة المخ باستخدام أحمر فلوري كاليفورنيا<sup> 2 +</sup> مؤشر صباغة.
Abstract
على الرغم من الزيادة الهائلة في معرفتنا عن الآليات الكامنة والترميز للمعلومات في الدماغ، والسؤال المركزي بشأن الخطوات الدقيقة الجزيئية فضلا عن نشاط الخلايا العصبية محددة في نواة متعددة الوظائف للمناطق الدماغ مثل منطقة ما تحت المهاد لا تزال قائمة. هذه المشكلة يتضمن تحديد المكونات الجزيئية المشاركة في تنظيم مختلف الاجهزة هرمون عصبي نقل الإشارة. من الكالسيوم داخل الخلايا ترتفع 2 + تلعب دورا هاما في تنظيم حساسية الخلايا العصبية، سواء على مستوى نقل الإشارة في مواقع ومتشابك.
ظهرت أدوات جديدة للمساعدة في تحديد الخلايا العصبية في الدماغ لا يحصى من الخلايا العصبية بالإعراب عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج معينة. لرصد كل من المكان والزمان التحفيز التي يسببها الكالسيوم 2 + الردود في GFP الموسومة الخلايا العصبية، وهي منظمة غير الفلورية الخضراء كا 2 + ن مؤشر صبغلاستخدامها eeds. وبالإضافة إلى ذلك، المجهري متحد البؤر هو وسيلة مفضلة من الخلايا العصبية الفردية في التصوير شرائح الأنسجة بسبب قدرته على تصور الخلايا العصبية في الطائرات متميزة من عمق داخل الأنسجة والحد من خارج التركيز مضان. كا 2 + مؤشر ratiometric FURA-2 وقد استخدم في تركيبة مع GFP الموسومة الخلايا العصبية 1. ومع ذلك، هو متحمس الصبغة بواسطة ضوء (UV) فوق البنفسجية. أعاقت تكلفة من الليزر وعمق الاختراق محدودة الضوئية للضوء UV استخدامه في العديد من المختبرات. وعلاوة على ذلك، قد GFP مضان تتداخل مع الإشارات FURA-2 2. لذلك، قررنا استخدام أحمر فلوري الكالسيوم مؤشر + 2 صباغة. التحول السكتات ضخمة من FURA متعدد الألوان الحمراء يسمح تحليل مضان أحمر في تركيبة مع GFP باستخدام الطول الموجي الإثارة واحد. كان لدينا نتائج جيدة في السابق باستخدام FURA الحمراء في تركيبة مع GFP الموسومة الخلايا العصبية الشمية 3. يبدو أن بروتوكولات لشرائح الأنسجة للعمل حاسة الشم هكذلك qually في الخلايا العصبية طائي 4. FURA الحمراء يعتمد كا 2 + وأيضا الجمع بين التصوير بنجاح مع خلايا البنكرياس β-GFP الموسومة وGFP الموسومة المستقبلات في الخلايا أعرب HEK 5،6. A هوس القليل من FURA الحمراء هو أن كثافة مضان في 650 نانومتر يقلل مرة واحدة في مؤشر يربط الكالسيوم 7. ولذلك، فإن مضان من الخلايا العصبية يستريح مع انخفاض تركيز الكالسيوم + 2 لديه كثافة عالية نسبيا. تجدر الإشارة إلى أن الأحمر أخرى CA 2 +-مؤشر الأصباغ موجودة أو يتم تطويرها حاليا، التي قد تعطي نتائج أفضل أو تحسين في الخلايا العصبية المختلفة، ومناطق الدماغ.
Protocol
Discussion
والسؤال الكبير هو في علم الأعصاب لفهم كيفية عمل الدماغ بمعالجة المعلومات الاجتماعية. يتم ترميز مصدر الغالبة من المعلومات اللازمة للاعتراف الاجتماعي من خلال حاسة الشم أو إشارات pheromonal. الكشف عن هذه الإشارات العصبية من قبل السكان في الأنف والاعتراف الإشارات في الدماغ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر زملائنا الذين شاركوا في أعمال تلخيص هنا. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث (SFB 894)، "تحليل التكاملية من الشم 'وSchwerpunktprogramm DFG 1392 وفولكس واجن من قبل مؤسسة (TLZ). TLZ أستاذ يشتنبرغ لمؤسسة فولكس واجن.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O’Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
- Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
- Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
- Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
- Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
- Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
- Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
- Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
- Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
- Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
- Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Properties of Asante Calcium Red – a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. , (2010).
