Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답
Summary
이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을 업데이트<sup> 2 +</sup빨간색 형광 칼슘을 사용하여 뇌 조직 조각에서 GFP 태그 뉴런의> 신호<sup> 2 +</sup> 표시기 염료.
Abstract
뇌의 정보의 인코딩, 정확한 분자 단계뿐만 아니라 시상 하부가 남아 같은 뇌 영역의 다기능 핵에서 특정 뉴런의 활동에 관한 중요한 질문에 근간이 메커니즘에 대한 우리의 지식에 엄청난 증가에도 불구하고. 이 문제는 여러 neurohormone의 신호 전달 폭포의 규정에 관련된 분자 구성 요소의 식별이 포함되어 있습니다. 세포 내 칼슘 2의 고도는 + 두 신호 전달의 수준과 신경 사이트에서, 뉴런의 감도를 조절에 중요한 역할을한다.
새로운 도구는 특정 발기인의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하여 뇌 뉴런의 무수한에서 뉴런을 식별하는 데 도움 등장했습니다. 모두 spatially 및 시간적 자극 – 유도 모니터링하려면 칼슘이 GFP 태그 뉴런, 비 녹색 형광 칼슘 2 + 지표 염료 N의 + 응답eeds는 사용할 수 있습니다. 또한, 공 촛점 현미경은 조직 내에서 깊이 독특한 비행기에서 뉴런을 시각화하고 밖에서 초점 형광를 제한 할 수있는 능력으로 인해 조직 조각의 이미지 개별 뉴런의 좋아하는 방법입니다. 뉴런 1 GFP 태그와 ratiometric 칼슘 2 + 표시 fura-2 조합에 사용되었습니다. 그러나 염료는 자외선 (UV) 빛 예정입니다. UV 빛의 레이저와 제한된 광학 침투 깊이의 비용은 많은 실험실에서의 사용을 방해. 또한, GFP 형광은 fura-2 신호를 2 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 저희는 빨간색 형광 칼슘 2 + 지표 염료를 사용하기로 결정했습니다. fura – 붉은 거대한 스트로크의 변화는 하나의 여기 파장을 사용하여 GFP와 함께 붉은 형광의 다색 분석을 할 수 있습니다. 우리는 후각 뉴런에게 3 GFP 태그와 함께 fura 빨간색을 사용하여 이전에 좋은 결과를했습니다. 후각 조직 슬라이스에 대한 프로토콜은 전자 일 듯qually 잘 hypothalamic 뉴런의 4. 카 2 기반 Fura – 레드 + 영상도 성공적으로 GFP 태그 췌장 β-세포와 HEK 세포 5,6로 표현 GFP 태그 수용체와 결합되었다. fura – 붉은 작은 장식 체로 그리기의 표시등이 칼슘 7 바인딩 후 650 nm의에서의 형광 강도가 감소한다는 것입니다. 따라서, 낮은 칼슘 2 + 농도와 휴식 뉴런의 형광은 상대적으로 높은 강도를 갖추고 있습니다. 이것은 주목해야한다, 다른 붉은 칼슘 2 + – 표시 염료가 없거나 현재 개발되고, 그 다른 뉴런과 뇌 영역에서 더 나은 또는 개선 된 결과를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
신경 과학의 주요 문제는 뇌 사회 정보를 처리 방법을 이해하는 것입니다. 사회적 인식에 필요한 정보의 주된 소스가 후각이나 pheromonal 신호에 의해 인코딩되어 있습니다. neuronal 코의 인구, 특히 뇌, 시상 하부에서 신호의 인식에 의해 이러한 신호의 감지는 많은 사회적 과정과 영향력 호르몬 및 기타 neuroendocrine 요소 13-16에서 핵심적인 역할을한다. 여러 뉴런과 다기능 핵을 포함하는 시?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 작업에 참가 동료는 여기에 요약 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 '후각의 통합 분석'에서 보조금 의해 폭스 바겐 재단 (TLZ)에 의해 지원되었다. TLZ는 폭스 바겐 재단의 Lichtenberg 교수입니다.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
Referências
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O’Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
- Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
- Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
- Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
- Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
- Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
- Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
- Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
- Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
- Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
- Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Properties of Asante Calcium Red – a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. , (2010).
