Neste protocolo, atualizar o progresso recente na imagem Ca 2 + Sinais de neurónios GFP-tagged em fatias de cérebro de tecido, utilizando um vermelho fluorescente Ca 2 + Corante indicador.
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Artigo de método
Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Apesar de um aumento enorme no nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes a codificação de informação no cérebro, a questão central sobre os passos precisos moleculares, bem como a actividade de neurónios específicos em multi-funcional núcleos de áreas cerebrais, tais como o hipotálamo permanecem. Este problema abrange a identificação dos componentes moleculares envolvidos na regulação de vários neuro-hormonais cascatas de transdução de sinal. Elevações de Ca 2 + intracelular desempenham um papel importante na regulação da sensibilidade de neurónios, quer ao nível de transdução de sinal e em locais sinápticos.
Novas ferramentas surgiram para ajudar a identificar os neurónios a miríade de neurónios do cérebro por expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo de um promotor particular. Para monitorar tanto espacialmente e temporalmente estímulo induzido Ca 2 + respostas em GFP-tagged neurônios, um não-verde fluorescente Ca 2 + indicador corante needs a ser utilizado. Além disso, a microscopia confocal é um método preferido de neurónios individuais de imagem em fatias de tecido devido à sua capacidade de visualizar os neurónios em planos distintos de profundidade dentro do tecido e para limitar fora de foco fluorescente. O Ca 2 + raciométrica indicador fura-2 tem sido utilizado em combinação com GFP-tagged neurônios 1. No entanto, o corante é excitada por luz ultravioleta (UV). O custo do laser e a profundidade de penetração limitada óptico da luz UV pode prejudicar a sua utilização em muitos laboratórios. Além disso, a GFP fluorescente pode interferir com os sinais de fura-2 2. Por isso, decidimos usar um vermelho fluorescente Ca 2 + corante indicador. A mudança Strokes enorme de fura-vermelho permite multicolor análise da fluorescência vermelha em combinação com GFP utilizando um comprimento de onda de excitação único. Tivemos bons resultados anteriormente usando fura-vermelho em combinação com GFP-tagged neurônios olfativos 3. Os protocolos para os cortes de tecidos olfactivos parecia estar a trabalhar eQually bem em neurônios do hipotálamo 4. Fura-vermelho base de Ca 2 + da imagem foram também combinados com sucesso com GFP-tagged β pancreáticas e células GFP-tagged receptores expressos em células HEK 5,6. Uma peculiaridade pouco de fura-vermelho é que a sua intensidade de fluorescência a 650 nm diminui uma vez que o indicador se liga de cálcio 7. Assim, a fluorescência de neurónios de repouso com baixa concentração de Ca + 2 tem intensidade relativamente alta. Note-se, que os outros vermelhos Ca 2 + indicadoras de corantes existem ou estão sendo desenvolvidos atualmente, que poderia dar melhores resultados ou melhores em neurônios e áreas diferentes do cérebro.
Protocolo
1. Preparação da solução de gel de agarose e
- Preparar a solução extracelular de acordo com a tabela, com água bi-destilada. O pH será ~ 7,3 após 10 minutos de arejamento com carbogénio (95% O2 / 5% CO 2), a osmolaridade de 300 mOsm 8. Se um maior osmolaridade é necessário, ele pode ser ajustado pela adição de mais glucose (1 mM é igual a 1 mOsm). A solução é filtrada duas vezes, utilizando um filtro de membrana de 0,2 ^ m a eliminar as partículas de poeira e de possíveis contaminações bacterianas.
| Nome do reagente | Abreviatura | <.... |
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Discussão
Uma questão importante em neurociência é compreender como o cérebro processa a informação social. A principal fonte de informações necessárias para o reconhecimento social é codificada por sinais olfativos ou pheromonal. A detecção destes sinais por populações neuronais no nariz e ao reconhecimento dos sinais no cérebro, especialmente o hipotálamo, desempenham um papel fundamental em muitos processos sociais e de hormonas e de outros factores de influência neuroendócrinos 13-16. Um obstáculo essencial de anal.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos aos nossos colegas que participaram do trabalho aqui resumidas. Este trabalho foi financiado por doações do Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), "análise integrativa do olfato" o DFG Schwerpunktprogramm 1392 e pela Fundação Volkswagen (TLZ). TLZ é professor Lichtenberg da Fundação Volkswagen.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Gato. N ° | |
| Agar | Sigma | A1296 | |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | |
| Dimetilsulfóxido | Fisher Scientific | BP231 | |
| Vibratório-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 | |
| Dispositivo de arrefecimento CU 65 para Micrótomo Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 | |
| O 2 / CO 2 Incubadora, CB210-UL | Encadernador | 0019389 | |
| Super cola, Loctite 406TM | Henckel | 142580 | |
| Espátulas duplas, forma colher | Bochem | 3182 | |
| Espátulas Microspoon, forma colher | Bochem | 3344 | |
| Tesoura de mola, Moria-Vannas-Wolff - Lâminas 7 milímetros | Belas Science Tools | 15370-52 | |
| Tesoura de mola, Vannas - Lâminas 3 milímetros | Belas Science Tools | 15000-00 | |
| Wagner Tesoura | Belas Science Tools | 14071-12 | |
| Médico Fórceps, 7b Dumont | Belas Science Tools | 11270-20 | |
| Câmara de banho grande retangular Aberto (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 | |
| Radiance BioRad Confocal Microscope 2100 | Zeiss | nd |
Referências
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices
Posted by JoVE Editors on 10/01/2012. Citeable Link.
There was a typo in the abstract of Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices.
