Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Summary

En este protocolo, actualizamos los recientes avances en imágenes Ca^{2 +} Señales de neuronas GFP-etiquetados en cortes de tejido cerebral con un rojo fluorescente Ca^{2 +} Indicador de tinte.

Abstract

A pesar de un aumento enorme en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la codificación de la información en el cerebro, una cuestión fundamental en relación con los pasos precisos molecular, así como la actividad de neuronas específicas en multi-funcional núcleos de áreas del cerebro tales como el hipotálamo permanecer. Este problema se incluye la identificación de los componentes moleculares implicados en la regulación de diversas neurohormonas cascadas de transducción de señales. Las elevaciones de Ca ^{2 +} intracelular desempeñan un papel importante en la regulación de la sensibilidad de las neuronas, tanto en el nivel de transducción de señales y en los sitios sinápticos.

Han surgido nuevas herramientas para ayudar a identificar las neuronas en la miríada de neuronas cerebrales mediante la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor particular. Para supervisar tanto espacial como temporalmente estímulo inducido por Ca ^{2 +} respuestas en GFP-etiquetados neuronas, un no-verde fluorescente Ca ^{2 +} colorante indicador nEEDS para ser utilizado. Además, la microscopía confocal es un método preferido de formación de imágenes de las neuronas individuales en rodajas de tejido debido a su capacidad para visualizar las neuronas en distintos planos de profundidad dentro del tejido y para limitar fuera de foco de fluorescencia. El ratiométrica Ca ^{2 +} indicador fura-2 se ha utilizado en combinación con GFP-etiquetados neuronas ^1. Sin embargo, el colorante es excitado por la luz ultravioleta (UV). El coste del láser y la limitada profundidad de penetración óptica de la luz UV impedido su uso en muchos laboratorios. Además, la fluorescencia de GFP puede interferir con las señales de fura-2 ^2. Por lo tanto, se decidió utilizar un color rojo fluorescente Ca ^{2 +} colorante indicador. El cambio Strokes enorme de fura-rojo multicolor permite el análisis de la fluorescencia de color rojo en combinación con GFP usando una longitud de onda de excitación única. Hemos tenido resultados buenos previamente utilizando fura-rojo en combinación con GFP-etiquetados neuronas olfativas ^3. Los protocolos para cortes de tejido olfativo parecía funcionar equally bien en las neuronas hipotalámicas ^4. Fura-red basada Ca ^{2 +} de imágenes también fue combinado con éxito con GFP-etiquetados β pancreáticas y células GFP-etiquetados receptores expresados ​​en células HEK ^5,6. Una peculiaridad de fura-red es que la intensidad de fluorescencia a 650 nm disminuye una vez que el indicador se une al calcio ^7. Por lo tanto, la fluorescencia de las neuronas en reposo con baja concentración de Ca ^{2 +} tiene una intensidad relativamente alta. Cabe señalar, que los otros rojos Ca ^{2 +-indicador} tintes existen o se están desarrollando, que podría dar mejores resultados o mejores en las neuronas y áreas diferentes del cerebro.

Protocol

1. Preparación de la solución y gel de agarosa Preparar la solución extracelular de acuerdo con la tabla con agua doblemente destilada. El pH se ~ 7,3 después de 10 minutos de aireación con carbógeno (95% O 2/5% CO 2), la osmolaridad de 300 mOsm 8. Si una osmolaridad superior se requiere, se puede ajustar mediante la adición de más glucosa (1 mm es igual a 1 mOsm). La solución se filtró dos veces usando un filtro de 0,2 micras membrana para eliminar partículas de po…

Discussion

Una cuestión importante de la neurociencia es comprender cómo el cerebro procesa la información social. Una fuente principal de información necesaria para el reconocimiento social está codificada mediante señales olfatorias o feromonas. La detección de estas señales por poblaciones neuronales en la nariz y el reconocimiento de las señales en el cerebro, especialmente el hipotálamo, juegan un papel clave en muchos procesos sociales y hormonas y otros factores de influencia neuroendocrinos ^13-16. Un o…

Materials

Name	Company	Cat. N°
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.