Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Summary

I detta protokoll uppdaterar vi senaste framstegen i bildbehandling Ca^{2 +} Signaler av GFP-märkta neuroner i skivor hjärnvävnad med en röd fluorescerande Ca^{2 +} Indikatorfärgämnet.

Abstract

Trots en enorm ökning av vår kunskap om de mekanismer som ligger bakom kodningen av information i hjärnan, en central fråga om de exakta molekylära stegen samt aktiviteten av specifika nervceller i multifunktionella kärnor av områden i hjärnan som hypotalamus kvar. Detta problem finns identifiering av de molekylära komponenterna involverade i regleringen av olika transduktion neurohormon signal kaskader. Förhöjda intracellulära Ca ^{2 +} spelar en viktig roll vid reglering av känsligheten av neuroner, såväl på nivån för signaltransduktion och vid synaptiska ställen.

Nya verktyg har skapats för att hjälpa till att identifiera neuroner i den myriad av hjärnans nervceller genom att uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av en viss promotor. Att övervaka både rumsligt och tidsmässigt stimulus-inducerad Ca ^{2 +} svar i GFP-märkta neuroner, en icke-grönt fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorfärgämne nEEDS användas. Dessutom, är konfokalmikroskopi en favorit metod för avbildning enskilda neuroner i vävnadsskivor grund av dess förmåga att visualisera neuroner i distinkta plan djupet i vävnaden och begränsa utanför fokus fluorescens. Den kvotmetriska Ca ^{2 +} indikator fura-2 har använts i kombination med GFP-märkt neuroner ^1. Emellertid färgämnet exciteras av ultraviolett (UV) ljus. Kostnaden för lasern och den begränsade optiska inträngningsdjupet för UV-ljus hindrat dess användning i många laboratorier. Vidare kan GFP-fluorescens interferera med fura-2 signalerna ^2. Därför bestämde vi oss för att använda en röd fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorfärgämne. Den enorma Strokes förskjutning av fura-röd tillåter multicolor analys av röd fluorescens i kombination med GFP med en enda excitationsvåglängd. Vi hade tidigare goda resultat med fura-röd i kombination med GFP-märkta lukt neuroner ^3. Protokollen för lukt vävnad skivor verkade fungera equally väl i hypotalamus neuroner ^4. Fura-röd baserade Ca ^{2 +} imaging har också framgångsrikt kombinerat med GFP-märkta pankreas β-celler och GFP-märkta receptorer som uttrycks i HEK celler ^5,6. En liten sarkasm i fura-röd är att dess fluorescensintensitet vid 650 nm minskar när indikatorn binder kalcium ^7. Därför har fluorescensen av vilande neuroner med lågt Ca ^{2 +} koncentrationen relativt hög intensitet. Det bör noteras, att andra röda Ca ^{2 +-indikatorfärgämnen} finns eller håller på att utvecklas, kan det ge bättre eller förbättrade resultat i olika nervceller och områden i hjärnan.

Protocol

1. Framställning av lösning och agarosgel Framställ extracellulära lösningen enligt tabellen med dubbeldestillerat vatten. PH kommer att vara ~ 7,3 efter 10 min luftning med karbogen (95% O 2/5% CO 2), osmolariteten 300 mOsm 8. Om en högre osmolaritet erfordras, kan den justeras genom tillsats av mer glukos (1 mM motsvarar 1 mOsm). Lösningen filtreras två gånger med en 0,2-filter im membran för att eliminera damm och eventuella bakteriella föroreningar. <t…

Discussion

En stor fråga inom neurovetenskap är att förstå hur hjärnan bearbetar social information. En dominerande källa till information som är nödvändig för socialt erkännande kodas av lukt eller feromonal signaler. Detektering av dessa signaler genom neuronala populationer i näsan och erkännande av signalerna i hjärnan, särskilt hypotalamus, spelar en viktig roll i många sociala processer och hormoner inflytande och andra neuroendokrina faktorer ^13-16. En väsentlig hinder att analysera neuronala sva…

Materials

Name	Company	Cat. N°
Agar	Sigma	A1296
Fura-red/AM	Invitrogen	F-3021
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Dimethyl sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9770170
Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50	Zeiss	9920120
O2/CO2 Incubator, CB210-UL	Binder	0019389
Super glue, Loctite 406TM	Henckel	142580
Double spatulas, spoon shape	Bochem	3182
Microspoon spatulas, spoon shape	Bochem	3344
Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades	Fine Science Tools	15370-52
Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades	Fine Science Tools	15000-00
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14071-12
Medical Forceps, Dumont 7b	Fine Science Tools	11270-20
Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27)	Warner Instruments	64-0238
Confocal Microscope BioRad Radiance 2100	Zeiss	n.a.