A Novel kirurgisk metod för intratrakeal administrering av bioaktiva ämnen i fosterställning musmodell
Summary
Vi utvecklade en ny kirurgisk metod för intratrakeal administration av bioaktiva medel i musen fostret. Leveransen rutten är mer effektivt i att rikta de fetala mus lungorna än den vanligtvis använda intra-amniotisk injektion. Detta förfarande har hittills inte beskrivits i en musmodell.
Abstract
Prenatal pulmonell leverans av celler, gener eller farmakologiska medel kan ligga till grund för nya terapeutiska strategier för olika genetiska och förvärvade sjukdomar. Förutom medfödda eller nedärvda avvikelser med kravet på en långsiktig uttryck av den levererade genen, flera icke-ärftliga perinatala tillstånd, där kortsiktiga genuttryck eller farmakologisk behandling är tillräcklig för att uppnå terapeutiska effekter, anses som potentiella framtida indikationer för detta typ av tillvägagångssätt. Kandidat sjukdomar för tillämpningen av kortsiktiga prenatal terapi kan vara övergående neonatal brist på tensidprotein B orsakar neonatal respiratorisk 1,2 distress syndrome eller hyperoxisk skador på nyfödda lungan 3. Kandidat sjukdomar för permanent terapeutisk korrigering är cystisk fibros (CF) 4, genetiska varianter av ytaktiva brister 5 och α1-antitrypsinbrist 6.
<p class = "jove_content"> I allmänhet är en viktig fördel av prenatal genterapi möjlighet att starta terapeutisk intervention tidigt i utvecklingen, vid eller med innan kliniska manifestationer i patienten, vilket förhindrar irreparabel skada på individen. Dessutom organ hos fostren har en ökad cellproliferation jämfört med vuxna organ, vilket kan ge en mer effektiv gen eller stamceller överföring till fostret. Vidare är i livmodern genleverans utförs när individens immunsystem är inte helt mogen. Därför bör transplantation av heterologa celler eller komplettering av ett icke-funktionellt eller frånvarande protein med en korrekt version orsakar inte immun sensibilisering till cellen, vektor eller transgen produkt, som nyligen har visat sig vara fallet med både cellulära och genetiska terapier 7 .I den aktuella studien undersökte vi möjligheten att direkt rikta fostrets luftstrupen i en mus mOdel. Detta förfarande används i större djurmodeller såsom kaniner och får 8, och även i en klinisk miljö 9, men har hittills inte utförts tidigare i en musmodell. När man studerar möjligheterna av fostrets genterapi för genetiska sjukdomar såsom CF är musmodell mycket användbar som ett första proof-of-concept på grund av den stora tillgången på olika transgena musstammar, väl dokumenterad embryogenes och fosterutveckling, mindre stränga etiska regler, kort dräktigheten och den stora kullstorleken.
Olika tillfartsvägar har beskrivits att rikta fostrets gnagare lunga, inklusive inom fostervatten injektion 10-12, (ultraljud-styrda) intrapulmonell injektion 13,14 och intravenös administrering i gulesäcken fartyg 15,16 eller navelsträng ven 17. Vår nya kirurgiskt ingrepp ger forskarna möjlighet att injicera medlet val direkt i fostrets mus luftstrupen som görför en mer effektiv leverans till luftvägarna än befintliga tekniker 18.
Protocol
Discussion
Kritiska steg
- Det musstam vi valde att arbeta med är NMRI möss eftersom de har en riklig antal ungar (genomsnittlig kullstorlek 14,4 ± 1,8, egna uppgifter), tål interventioner väl och har goda mödrar egenskaper.
- Placering väskan strängen genom livmoderväggen och fosterhinnorna är ett kritiskt steg som du bara vill exponera fostrets huvud och inte axlarna, annars omplacering är nästan omöjligt utan att orsaka skada.
- En optimal position av fostrets huvud sträckte bakåt är väs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MC och AVdP är docs finansierats med bidrag från Institutet för främjande av innovation genom vetenskap och teknik i Flandern (IWT-Vlaanderen). JT har en deltid Clinical Research Fellowship (Koor) från UZ Leuven. DV är doktorand stöds av ett bidrag från KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC är doktorand stöds av ett bidrag från Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) och Erasmus Mundus. Forskningen har finansierats av IWT-Vlaanderen, av EG bidraget Dimi (LSHB-CT-2005 till 512.146) och in vivo Molecular Imaging Research Group (IMIR) från KU Leuven. Vi vill erkänna UPenn vektor Kärna grundades av James M. Wilson för deras vänliga gåva AAV6.2 förpackningar plasmiden för rAAV vektor produktion.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
Referências
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
