Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit
Summary
Fibroblasten von Patienten mit Mutationen in der Parkinson-Krankheit verursachenden Gene stellen ein leicht zugängliches<em> Ex vivo</em> Modell krankheits-assoziierte Phänotypen studieren. Live Cell Imaging bietet die Möglichkeit, morphologische und funktionelle Parameter in lebenden Zellen zu studieren. Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Fibroblasten und anschließende Überwachung der mitochondrialen Phänotypen.
Abstract
Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste Bewegungsstörung und betrifft 1% der Menschen im Alter von über 60 1. Da Altern ist der wichtigste Risikofaktor, wird Fälle von PD in den nächsten Jahrzehnten 2 zu erhöhen. Weiter zu pathologischen Proteinfaltung und eingeschränkter Protein Abbauwege wurden Veränderungen der mitochondrialen Funktion und Morphologie als weitere Markenzeichen der Neurodegeneration bei PD 3-11 hingewiesen.
Nach Jahren der Forschung in murinen und humanen Krebszellen in vitro Modellen zur molekularen Mechanismen der Parkinson sezieren, hat die Verwendung von menschlichen Fibroblasten von Patienten und entsprechende Kontrollen als Ex-vivo-Modelle zu einem wertvollen Recherche-Tool, wenn potenzielle Einschränkungen berücksichtigt werden. Anders als unsterblich, sondern künstliche Zelle Modelle primären Fibroblasten von Patienten tragen krankheits-assoziierte Mutationen scheinbar reflektieren wichtige pathologische Merkmale of die humane Erkrankung.
Hier beschreiben das Verfahren der Einnahme Hautbiopsien, Kultivierung humaner Fibroblasten und mit detaillierten Protokollen für wesentliche mikroskopischen Techniken zu mitochondrialen Phänotypen zu definieren. Diese wurden verwendet, um verschiedene Funktionen mit PD verbunden, die relevant für die Funktion der Mitochondrien und Dynamik untersuchen. Ex vivo kann Mitochondrien über den lysosomalen Weg im Hinblick auf ihre Funktion, Morphologie, Kolokalisation mit Lysosomen (die Organellen abbauenden dysfunktionellen Mitochondrien) und Degradation analysierenden . Diese Phänotypen höchst relevant sind für die Identifizierung von frühen Zeichen der PD und können klinische motorischen Symptome in menschlichen Krankheiten Genträgern vorausgehen. Somit können die hier dargestellten Assays als wertvolle Werkzeuge verwendet werden, um pathologische Merkmale von Neurodegeneration identifizieren und dazu beitragen, neue therapeutische Strategien PD definieren.
Protocol
Discussion
Patient Hautfibroblasten als ex vivo Modelle stellen ein wichtiges Instrument zur krankheits-assoziierte genetische Defekte zu charakterisieren. Darüber hinaus sind Haut-abgeleiteten Fibroblasten leicht zugänglich und kann bei Kultivierung erweitert werden. Daher sind primäre Zellen von Patienten tragenden PD-assoziierten genetischen Mutationen erhaltenen gegenüber der Verwendung von Tumorzelllinien bevorzugt, da sie nicht nur das endogene krankheitsverursachende Gen, sondern das gesamte genetische Hintergr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Fritz-Thyssen-Stiftung (10.11.2.153, RK), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KR2119/3-2 und KR2119/8-1, RK), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF unterstützt , NGFNplus; 01GS08134, RK) und durch ein Promotionsstipendium von der gemeinnützigen Hertie-Stiftung [zu LFB]. Wir danken Carolin Obermaier und Julia Westermeier für ihre Unterstützung während der Videoaufnahme.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
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