L'uso di fibroblasti umani primari per il monitoraggio fenotipi mitocondriali nel campo della malattia di Parkinson
Summary
I fibroblasti di pazienti portatori di mutazioni nel Parkinson geni che causano malattie rappresentano un facile accesso<em> Ex vivo</emModello> per studiare le malattie associate a fenotipi. Imaging cellulare vivo dà la possibilità di studiare parametri morfologici e funzionali nelle cellule viventi. Qui si descrive la preparazione di fibroblasti umani e successivamente controllare fenotipi mitocondriali.
Abstract
Morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo movimento più comune e colpisce l'1% delle persone di età superiore ai 60 1. Poiché l'invecchiamento è il fattore di rischio più importante, i casi di PD aumenterà nei prossimi decenni 2. Accanto al ripiegamento delle proteine patologiche e deteriorate vie di degradazione delle proteine, alterazioni della funzione mitocondriale e la morfologia sono stati additati come segno distintivo ulteriore della neurodegenerazione nella malattia di Parkinson 3-11.
Dopo anni di ricerca in cellule tumorali murine ed umane come modelli in vitro per analizzare vie molecolari di parkinsonismo, l'uso di fibroblasti umani da pazienti e controlli appropriati come modelli ex vivo è diventato un valido strumento di ricerca, se caveat potenziali sono considerati. Oltre immortalizzate, modelli cellulari piuttosto artificiali, fibroblasti primari di pazienti portatori di malattie associate a mutazioni apparentemente riflettere importanti caratteristiche patologiche of la malattia umana.
Qui delineare la procedura di presa di biopsie cutanee, la coltura fibroblasti umani e l'utilizzo di protocolli di modalità di tecniche microscopiche essenziali per definire fenotipi mitocondriali. Questi sono stati utilizzati per studiare diverse caratteristiche associate a PD che sono rilevanti per la funzione mitocondriale e la dinamica. Ex vivo, mitocondri può essere analizzato in termini di funzione, morfologia, colocalizzazione con i lisosomi (organelli mitocondri degradanti disfunzionale) e la degradazione attraverso la via lisosomiale . Questi fenotipi sono molto importanti per l'identificazione di segni precoci di PD e possono precedere i sintomi motori clinici umani malattia gene-vettori. Quindi, i saggi qui presentati possono essere utilizzati come strumenti preziosi per identificare le caratteristiche patologiche di neurodegenerazione e contribuiscono a definire nuove strategie terapeutiche in PD.
Protocol
Discussion
Fibroblasti cutanei dei pazienti come modelli ex vivo rappresentano un importante strumento per caratterizzare difetti genetici associata a malattia. Inoltre, la pelle derivati fibroblasti sono facilmente accessibili e possono essere estesa, coltura. Pertanto, cellule primarie ottenute da pazienti portatori PD-associata mutazioni genetiche sono preferibili l'uso di linee cellulari tumorali in quanto contengono non solo la endogena causante malattia gene, ma l'intero background genetico dell'in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Fritz Thyssen (10.11.2.153 a RK), il tedesco Research Council (DFG, KR2119/3-2 e KR2119/8-1 a RK), il Ministero federale dell'Istruzione e della ricerca (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 a RK) e da una borsa di studio di dottorato dal caritatevole Fondazione Hertie [di LFB]. Ringraziamo Carolin Obermaier e Julia Westermeier per il loro supporto durante le riprese video.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
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