Estrazione di antigeni dei tessuti per test funzionali
Summary
Un semplice protocollo per la preparazione di estratti di tessuto umano da utilizzare come fonte di antigeni a cellule T funzionali saggi è descritto. Questo metodo consente risposte delle cellule T al tessuto-antigeni derivati da misurare<em> In vitro</em>.
Abstract
Molti degli obiettivi di antigene risposta immunitaria adattativa, riconosciuti da cellule T e B, non sono stati definiti 1. Ciò è particolarmente vero per le malattie autoimmuni e il cancro 2. Il nostro obiettivo è quello di studiare gli antigeni riconosciuti dalle cellule T nel tipo di malattia autoimmune 1 diabete 1,3,4,5. Per analizzare umani risposte delle cellule T contro il tessuto in cui gli antigeni riconosciuti da cellule T non sono identificati abbiamo sviluppato un metodo per estrarre antigeni proteici da tessuto umano in un formato compatibile con saggi funzionali 6. Risposte precedentemente, cellule T ad estratti di tessuto non purificati non potevano essere misurati perché i metodi di estrazione produrre un lisato che conteneva detergenti tossiche per cellule mononucleari del sangue periferico. Qui si descrive un protocollo per estrarre proteine da tessuti umani in un formato che non è tossico per le cellule T umane. Il tessuto è omogeneizzato in una miscela di butan-1-olo, acetonitrile e water (BAW). La concentrazione proteica nel tessuto estratto viene misurato e una massa nota di proteina è frazionato in provette. Dopo l'estrazione, i solventi organici vengono rimossi mediante liofilizzazione. Estratti di tessuti liofilizzati possono essere memorizzati fino al momento. Per l'uso in saggi di funzione immunitaria, una sospensione di cellule del sistema immunitario, in terreni di coltura appropriati, possono essere aggiunti direttamente al estratto liofilizzato. Proliferazione e produzione di citochine da PBMC, in risposta a estratti preparati utilizzando questo metodo, sono stati facilmente misurata. Quindi, il nostro metodo permette la rapida preparazione di lisati di tessuto umano che possono essere utilizzati come fonte di antigeni nell'analisi delle risposte delle cellule T. Suggeriamo che questo metodo faciliterà l'analisi delle risposte immunitarie adattative ai tessuti nei trapianti, cancro e malattie autoimmuni.
Protocol
Discussion
Questo protocollo è stato sviluppato perché volevamo per generare un estratto dal tessuto umano che è stato esente da sostanze chimiche tossiche come i detersivi. Specificamente abbiamo utilizzato per preparare estratti di tessuto umano che possono essere utilizzati in saggi di funzione immunitaria umana in vitro. Estratti preparati usando questo protocollo può ugualmente essere ricostituito in qualsiasi buffer e usato per molte analisi biochimiche, quali la cromatografia in western blotting o liquido. Ciò…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) e la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e il progetto di infrastruttura operativa del Governo del Victoria. Ringraziamo i membri del Team Tom Mandel Islet Programma di trapianto di isole di isolamento per fornire i tessuti umani. I tessuti umani sono stati raccolti ed utilizzati con il locale approvazione etica (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 e Salute San Vincenzo HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
