Добыча тканевых антигенов для функциональных анализов
Summary
Простой протокол для подготовки экстрактов тканей человека для использования в качестве источника антигенов в функциональных Т-клеточных анализов описаны. Этот метод позволяет Т-клеточный ответ на ткани антигенов для измерения<em> В пробирке</em>.
Abstract
Многие из антигена целей адаптивного иммунного ответа, признанного B и Т-клетки, которые не были определены 1. Это особенно актуально при аутоиммунных и онкологических заболеваний 2. Нашей целью является исследование антигенов признан человеческий Т-клеток в аутоиммунных болезней типа диабета 1 1,3,4,5. Для анализа человеческого Т-клеточного ответа против ткани, где антигенов признан Т-клетки не выявлены мы разработали метод извлечения белковых антигенов от человеческих тканей в формат, совместимый с функциональными анализы 6. Ранее, Т-клеточный ответ на неочищенных экстрактах ткани не может быть измерено, потому что добыча методы дают лизат, содержащий моющие средства, которые были токсичными для человека мононуклеарных клеток периферической крови. Здесь мы опишем протокол для извлечения белков из тканей человека в формате, который не является токсичным для человеческого Т-клеток. Ткани гомогенизируют в смеси бутан-1-ол, ацетонитрил и Ватэр (BAW). Концентрация белка в тканях экстракта измеряют и известная масса белка аликвоты в пробирки. После извлечения органических растворителей удаляются путем лиофилизации. Лиофилизированный экстракт ткани могут храниться до необходимости. Для использования в анализах функции иммунной системы, подвески иммунных клеток, в соответствующих средствах массовой информации культуре, может быть добавлена непосредственно в лиофилизированного экстракта. Производство цитокинов и пролиферацию PBMC в ответ на экстракты, приготовленные с помощью этого метода, было легко измерить. Таким образом, наш метод позволяет быстро подготовка человека лизатов ткани, которые могут быть использованы в качестве источника антигенов в анализе Т-клеточного ответа. Мы полагаем, что этот метод будет способствовать анализ адаптивного иммунного ответа тканей при трансплантации, рак и аутоиммунные заболевания.
Protocol
Discussion
Этот протокол был разработан, потому что мы хотели создать выписку из тканей человека, которая была свободна от токсичных химических веществ, таких как моющие средства. В частности, мы использовали его для подготовки экстрактов тканей человека, которые могут быть использованы в анализ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке грантов от Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC # 559007) и детского диабета исследовательский фонд (JDRF 4-2006-1025) и схема работы инфраструктуры правительства штата Виктория. Мы благодарим членов Tom Mandel трансплантации островков Программа Команда изоляции островок для обеспечения тканей человека. Ткани человека были собраны и использованы с местными этические утверждения (больница Святого Винсента HREC-A 011/04 и здоровью Сент-Винсент HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referências
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
